Другие технологии переноса (блота), например, вестерн-блоттинг , нозерн-блоттинг , саузвестерн-блоттинг используют сходные методы, но для определения РНК или белка в образце, и называются по образцу метода, придуманного Саузерном. Так как Саузерн-блот назван по имени ученого, термин пишут с заглавной буквы, в то время как вестерн-блот и нозерн-блот - со строчной буквы.

Метод

1. Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты.
2. Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.
3. В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой , которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану.
4. В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК .
5. Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.
6. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран).
7. Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной.
8. После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путём авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).

Результаты

Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закрепленным на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе.

Применение

Саузерн-блоттинг, который проводят с геномной ДНК, обработанной эндонуклеазами рестрикции , может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, которая гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями. Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводят к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.

Напишите отзыв о статье "Саузерн-блот"

Примечания

См. также

Альфа-спираль

Это заготовка статьи по биохимии . Вы можете помочь проекту, дополнив её.

Отрывок, характеризующий Саузерн-блот

– Бессмертие, милая... Всего лишь бессмертие. Но он, к сожалению, не понимает, что оно не даётся просто из-за того, что кто-то этого хочет. Оно даётся, когда человек этого стоит, когда он ВЕДАЕТ то, что не дано другим, и использует это во благо остальным, достойным людям... Когда Земля становится лучше оттого, что этот человек живёт на ней.
– А зачем оно ему, мама? Ведь бессмертие – когда человек должен жить очень долго? А это очень непросто, правда? Даже за свою короткую жизнь каждый делает много ошибок, которые потом пытается искупить или исправить, но не может... Почему же он думает, что ему должно быть дозволенно совершить их ещё больше?..
Анна потрясала меня!.. Когда же это моя маленькая дочь научилась мыслить совершенно по-взрослому?.. Правда, жизнь не была с ней слишком милостивой или мягкой, но, тем не менее, взрослела Анна очень быстро, что меня радовало и настораживало одновременно... Я радовалась, что с каждым днём она становится всё сильней, и в то же время боялась, что очень скоро она станет слишком самостоятельной и независимой. И мне уже придётся весьма сложно, если понадобится, её в чём-то переубедить. Она всегда очень серьёзно относилась к своим «обязанностям» Ведуньи, всем сердцем любя жизнь и людей, и чувствуя себя очень гордой тем, что когда-нибудь сможет помогать им стать счастливее, а их душам – чище и красивей.
И вот теперь Анна впервые встретилась с настоящим Злом... Которое безжалостно ворвалось в её очень хрупкую ещё жизнь, уничтожая горячо любимого отца, забирая меня, и грозя стать жутью для неё самой... И я не была уверена, хватит ли ей сил бороться со всем одной в случае, если от руки Караффы погибнет вся её семья?..
Отпущенный нам час пролетел слишком быстро. На пороге, улыбаясь, стоял Караффа...
Я в последний раз прижала к груди мою любимую девочку, зная, что не увижу её теперь очень долго, а может даже и никогда... Анна уезжала в неизвестное, и я могла надеяться только лишь на то, что Караффа по-настоящему хотел её учить для своих сумасшедших целей и в таком случае, хоть на какое-то время ей ничто не грозит. Пока она будет находиться в Мэтэоре.
– Вы насладились общением, мадонна? – деланно искренне спросил Караффа.
– Благодарю Вас, Ваше святейшество. Да, конечно же. Хотя, я бы предпочитала сама растить свою дочь, как это принято в нормальном мире, а не отдавать её в руки неизвестным, только потому, что Вы имеете на неё какой-то свой план. Не хватит ли боли для одной семьи, Вы не находите?
– Ну, это смотря для какой, Изидора! – улыбнулся Караффа. – Опять же, есть «семья» и СЕМЬЯ... И Ваша, к сожалению, принадлежит ко второй категории... Вы слишком сильны и ценны, чтобы просто так жить, не платя за свои возможности. Запомните, моя «великая Ведьма», всё в этой жизни имеет свою цену, и за всё приходится платить, вне зависимости от того, нравится Вам это или нет... И уж Вам, к сожалению, придётся платить очень дорого. Но не будем говорить о плохом сегодня! Вы ведь провели чудесное время, не так ли? До встречи, мадонна. Я обещаю Вам, она будет очень скоро.
Я застыла... Как же знакомы были мне эти слова!.. Эта горькая правда так часто сопровождала меня в моей, коротенькой ещё, жизни, что я не могла поверить – слышу их от кого-то ещё!.. Наверное, это и впрямь было верно, что платить приходилось всем, только не все шли на это добровольно... И ещё иногда эта плата являлась слишком дорогой...
Стелла удивлённо вглядывалась в моё лицо, видимо заметив моё странное замешательство. Но я тут же показала ей, что «всё в порядке, всё хорошо», и, замолчавшая на мгновение, Изидора, продолжала свой прерванный рассказ.
Караффа удалился, уводя мою дорогую малышку. Окружающий мир померк, а моё опустошённое сердце капля за каплей медленно заполнялось чёрной, беспросветной тоской. Будущее казалось зловещим. В нём не было никакой надежды, не было привычной уверенности в том, что, как бы сейчас не было трудно, но в конце концов всё как-нибудь образуется, и обязательно будет всё хорошо.

Купить домофоны с вызывной панелью.

Саузерн блоттинг

Саузерн блоттинг — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделенной по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. Метод называется по имени изобретателя, английского биолога Эдвина Саузерна.

Другие технологии переноса, например, вестерн блоттинг, нозерн блоттинг, саузвестерн блоттинг используют сходные методы, но для определения РНК или белка в образце, и называются по образцу метода, придуманного Саузерном. Так как Саузерн-блот назван по имени ученого, термин пишут с заглавной буквы, в то время как вестерн-блот и нозерн-блот — со строчной буквы.

Метод

1. Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты.
2. Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.
3. В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану.
4. В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.
5. Листок нитроцеллюлозной мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды. При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.
6. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением.
7. Осуществляют гибридизацию радиоактивно меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной.
8. После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путем авторадиографии или оценивают окраску мембраны.

Репортёрный ген

Конкретного гена предполагает возможность различить специфические сегменты ДНК или молекулы РНК, соответствующие этому гену, среди множества других сегментов ДНК или молекул РНК, присутствующих в образце клеток или ткани. Когда анализируют геномную ДНК, проблема состоит в том, чтобы обнаружить и изучить специфический интересующий фрагмент ДНК в сложной смеси, содержащей несколько миллионов фрагментов, полученных расщеплением геномной ДНК рестриктазами. С образцами РНК сложность в том, чтобы обнаружить и измерить объем и качество конкретной копии мРНК в суммарной РНК ткани, в которой искомая мРНК составляет менее 1 на 1000 от общего числа копий РНК.

Решение проблемы обнаружения одной редкой последовательности среди множества других связано с использование гель-электрофореза для разделения молекул ДНК или РНК по размеру с последующей гибридизацией с нуклеотидным зондом, идентифицирующим интересующую молекулу.

Техника Саузерн-блоттинга (блоттинга по Саузерну) позволяет обнаружить и изучать на грубом уровне множество интересующих фрагментов в, казалось бы, не информативной коллекции из порядка миллиона фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазами. Саузерн-блоттинг, разработанный в середине 1970-х годов, стал стандартным методом исследования конкретных фрагментов ДНК, расщепленной ферментами рестрикции. Сначала в ходе этой процедуры из доступного источника выделяют ДНК. Как источник ДНК может быть использована любая клетка организма, за исключением зрелых эритроцитов, не имеющих ядра.

В ходе анализа образцов ДНК пациента обычно используют геномную ДНК лимфоцитов, полученных при обычной пункции вены. В 10 мл периферической крови содержится приблизительно 108 лейкоцитов или около 100 микрограмм ДНК - доза, достаточная для расщепления рестриктазами. Геномная ДНК также может быть получена из других тканей, включая культуру фибробластов кожи, амниотических клеток или ворсин хориона, что используют для пренатальной диагностики, или из биопсийного образца ткани различных органов (например, печени, почки, плаценты).

Пробу с миллионами различных фрагментов ДНК , генерируемых ферментативным расщеплением образца геномной ДНК рестриктазами, наносят на поверхность агарозного геля в точку старта. Затем фрагменты ДНК разделяют по размеру с помощью электрофореза в геле агарозы, при котором мелкие частицы перемещаются в электрическом поле быстрее крупных. Когда разделенную таким образом исследуемую ДНК окрашивают флюоресцентным красителем, например этидиум бромидом, фрагменты ДНК проявляются как флюоресцирующие области, распределенные вдоль полосы движения в геле, меньшие фрагменты - выше, большие - ниже. ДНК появляется в геле как смазанное пятно, а не в виде дискретных полос, поскольку обычно образуется слишком много разноразмерных фрагментов ДНК, чтобы отделить один от другого.

Пятно двухнитевых фрагментов ДНК сначала денатурируют сильной щелочью для разделения нитей ДНК. Полученные однонитевые молекулы ДНК затем переносят с геля на бумажные пористые фильтры (отсюда второе название метода - «перенос по Саузерну»).

Для идентификации одного или нескольких интересующих фрагментов среди миллионов других фильтр инкубируют с комплементарным однонитевым меченым зондом в условиях, способствующих спариванию двойных молекул ДНК. Несвязанные зонды удаляют отмывкой, затем фильтр со связанными радиоактивными зондами выдерживают с фотопленкой, что выявляет положение одного или более фрагментов, к которым присоединился зонд. Таким образом, на пленке можно увидеть специфические радиоактивные полосы для каждого интересующего фрагмента ДНК человека на исходном геле.

Способность Саузерн-блоттинга идентифицировать мутации ограниченная, поскольку зонды могут обнаруживать дефекты, только имеющие ощутимое влияние на размер рестрикционного фрагмента, например крупные делеции или инсерции (вставки). Мутация, изменяющая одно или несколько оснований, не может быть обнаружена, если не создает или не уничтожает сайт узнавания рестриктазы, приводя к значительному изменению размера фрагмента, обнаруживаемого зондом. Тем не менее, кроме Саузерн-блоттинга, существует множество методов для обнаружения мутаций, влияющих на одну или несколько пар оснований в гене.

После того как ДНК, РНК или белки разделены, они должны быть перенесены на твердую подложку для детекции и других операций, которые в геле идут с трудом. Процесс переноса, приводящий к иммобилизации молекул , т.е. закреплению в неподвижном состоянии, называется блоттингом (по англ. – blotting ). В качестве подложки используются нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны.

Блоттинг (от англ. blotting – промокание) – это метод перенесения электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы, связывающую (иммобилизующую) одноцепочечные молекулы ДНК.

Саузерн-блоттинг (по фамилии предложившего его автора) основан на перемещении фрагментов ДНК благодаря капиллярному эффекту. Процесс переноса фрагментов ДНК, находящихся в агарозном геле, на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги похож на промокание.

Анализ проводят следующим образом:

– Выделенную, очищенную, денатурированную и разбитую на фрагменты ДНК помещают на лист агарозного геля, где происходит электрофоретическое разделение фрагментов по массе и заряду.

– Лист агарозного геля помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным солевым (буферным) раствором.

– Затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, где происходит иммобилизация (или адсорбция, или фиксация) одноцепочечных фрагментов ДНК.

– Поверх фильтра накладывают стопку листов сухой фильтровальной бумаги, которая обеспечивает медленный ток буферного раствора через гель (т.е. служит своеобразным капиллярным насосом). Солевой раствор, проходя через агарозный гель, увлекает за собой фрагменты ДНК, которые задерживаются нитроцеллюлозой и связываются с ней, а раствор впитывается сухой фильтровальной бумагой.

– Далее ДНК денатурируют щелочью, а фильтр выдерживают в вакууме при температуре 80 0 С, в результате чего одноцепочечные фрагменты ДНК необратимо иммобилизуются (фиксируются) на нитроцеллюлозе. При этом расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

– ДНК, связанную с фильтром, помещают в раствор с меченым ДНК зондом, в котором и происходит гибридизация. Гибридизироваться (образовывать водородные связи) со специфическим зондом будут только комплементарные ему фрагменты ДНК, которые можно обнаружить в виде светлых полос на рентгеновской пленке, т.е. радиоавтографии нитроцеллюлозного фильтра

Дот-блоттинг . Для приготовления дот-блоттов препарат ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр. Капельки препарата выглядят в виде точек на фильтре, что объясняет название типа блоттинга (англ. dot –точка). 1) Из геномной ДНК, предварительно обработанной ультразвуком, образуются фрагменты длиной 5–10 пар нуклеотидов.

2) Чтобы сделать ДНК- или РНК-пробы доступными зонду, их нужно денатурировать, т.е. перевести в одноцепочечную форму. Это происходит под воздействием температуры 100 °С.

3) Денатурированные нуклеиновые кислоты инкубируют на льду: быстрое понижение температуры предотвращает их ренатурацию, т.е. комплементарное спаривание цепей. Денатурированную ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр, который инкубируют в растворе, содержащем зонд.

4) Чтобы анализируемая нуклеиновая кислота не перешла в раствор, ее необходимо зафиксировать на фильтре (мембране). Для этого используют два типа фильтров: нитроцеллюлозный и нейлоновый.

Для иммобилизации нуклеиновых кислот на нитроцеллюлозном фильтре используют прожаривание при 80 °С в вакууме, а на нейлоновом фильтре – УФ-облучение в течение 3–5 минут.

5) После инкубации препарата нуклеиновых кислот с меченым изотопом зондом проводят радиоавтографию в специальной кассете или идентификацию нерадиоактивными методами.

Дот-блоттинг позволяет ответить только на один вопрос: есть ли в данном образце искомая последовательность нуклеотидов.

Нозерн-блотт анализ применяется:

1) для выделения и анализа РНК (например, для выяснения того, присутствует ли в данном типе клеток мРНК, считанные с данного гена, т.е. экспрессируется ген или нет;

2) для определения количества этой РНК и его изменения в развитии данного типа клеток;

3) для определения размера транскрипта какого-то гена.

В данном случае молекулы РНК, выделенные из клетки, разделяются по размерам с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются места гибридизации (гомологии) РНК и зонда.

Если нуклеотидная последовательность искомого гена (или мРНК) не известна, но известен белок, синтез которого он контролирует, то можно выделить небольшое количество чистого белка, определить аминокислотную последовательность некоторой его части (достаточно знание 5–6 аминокислотных остатков). Пользуясь таблицей генетического кода, можно установить все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК (или самого гена), который кодирует данную аминокислотную последовательность. В этом случае можно синтезировать зонд для поиска нужных клонов в библиотеке генов.

Вестерн-блоттин г (иммуноэлектроблоттинг, белковый блоттинг) –это метод идентификации уникальных белков. В его основе лежит явление высокоспецифичного взаимодействия антиген–антитело. Таким образом, антигеном (мишенью) является определяемый белок, а зондом – антитело к нему.

Антитела к исследуемому белку получают различными способами. Наиболее простым является введение очищенной пробы белка в кровяное русло лабораторного животного (обычно кролика). В его организме вырабатываются антитела (иммуноглобулины) к данному чужеродному белку. Это первичные антитела, которые и будут взаимодействовать с белком-мишенью.

Однако было бы не рационально вводить метку для идентификации непосредственно в данные антитела. Для определения разных белков потребовалось бы метить разные антитела, что привело бы к их высокой стоимости. Более разумным оказалось использование универсальных антител – конъюгированных антииммуноглобулинов , являющихся, по сути, антителами к антителам, выработанным при использовании идентифицируемого белка как антигена. К примеру, конъюгированные антииммуноглобулины к Ig кролика будут взаимодействовать со всеми иммуноглобулинами, синтезированными у кролика к разным антигенам. Таким образом, именно такие универсальные вторичные антитела несут изотопную или нерадиоактивную метку. Кроме неизотопной метки, которая в ходе ряда реакций приводит к образованию нерастворимого окрашенного соединения (как в случае блоттинга нуклеиновых кислот), очень часто используют хемилюминесцентную метку, обладающую более высокой чувствительностью.

1) Экстракция белков из гомогената

2) Разделение белков по молекулярным массам с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Метод SDS-электрофореза подразумевает денатурацию нативных белков. Таким образом, молекулы белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, пройдут в геле одинаковый путь и выстроятся в виде полосы. Поскольку в смеси присутствуют белковые молекулы разного размера, образуется множество полос. Визуализировать результаты электрофореза можно окрашиванием белка (кумасси бриллиантовый синий, амидо черный, окрашивание серебром). Окрашивание серебром обладает уникальной чувствительностью, что позволяет определить всего 0,1 нг белка в полученной полосе. Это очень важно для контроля количества белка, нанесенного на гель.

3) Перенос белков из геля на мембрану. Это делается потому, что полиакриламид не позволяет диффундировать большим молекулам иммуноглобулинов к белку. А иммобилизованный на мембране белок становится доступным антителам. В отличие от блоттинга нуклеиновых кислот перенос белка на мембрану происходит под воздействием электрических сил, т.е. в электрическом поле.

4) Полученный блот инкубируют с антисывороткой к белку, а затем с антииммуноглобулинами. Результат визуализируют в соответствии с используемым типом метки.

Ограничения:

1) большой размер исследуемых фрагментов, значительно превосходящий длину ДНК-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу;

2) невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяющихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК;

3) необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию, что равноценно 0,5-1 мл крови),

4) для геномной гибридизации - наличие радиоактивных ДНК-зондов с высокой удельной активностью не менее 109 имп./мин*мкг), действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока. К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов.

5) большая трудоемкость исследований