Western blotting, Northern blotting, Southern blotting зэрэг бусад дамжуулах (blotting) технологиуд нь ижил төстэй аргуудыг ашигладаг боловч дээжинд РНХ эсвэл уураг илрүүлэхэд ашигладаг бөгөөд эдгээрийг Southern-ийн зохион бүтээсэн аргын нэрээр нэрлэсэн. Southern blot нь эрдэмтний нэрээр нэрлэгдсэн тул нэр томьёог том үсгээр, Western blot болон Northern blot-ийг жижиг үсгээр бичдэг.
Арга
- Хязгаарлалтын эндонуклеазууд нь өндөр молекул жинтэй ДНХ-г жижиг хэсгүүдэд хуваасан.
- ДНХ-ийн хэсгүүдийг агароз гель дээр электрофорезжуулж, уртыг ялгана.
- Зарим ДНХ-ийн фрагментууд 15 кб-аас урт байвал гелийг шилжүүлэхийн өмнө жишээлбэл, давсны хүчилээр эмчилдэг бөгөөд энэ нь ДНХ-ийн цэвэршилтийг үүсгэж, мембран руу шилжихэд тусалдаг.
- Шүлтлэг дамжуулах аргыг ашиглах үед агароз гель нь шүлтлэг уусмалд байрлуулсан бөгөөд энэ нь ДНХ-ийн давхар спиральыг денатурат болгож, сөрөг цэнэгтэй ДНХ-ийг эерэг цэнэгтэй мембрантай холбож цаашдын эрлийзжилтийг хөнгөвчилдөг. Энэ тохиолдолд үлдсэн РНХ мөн устаж үгүй болно.
- Нитроцеллюлоз (эсвэл нейлон) мембраны хуудсыг агароз гель дээр эсвэл доод талд байрлуулна. Даралтыг гель дээр шууд эсвэл хэд хэдэн давхаргаар цаасаар хийдэг. Амжилттай шилжүүлэхийн тулд гель ба мембраны хооронд нягт холбоо барих шаардлагатай. Буферийг капиллярын хүчээр ус ихтэй газраас ус багатай (мембран) руу зөөдөг. Энэ нь ДНХ-ийг гельээс мембран руу шилжүүлэх явдал юм. Полианионик ДНХ нь ион солилцооны харилцан үйлчлэлээр эерэг цэнэгтэй мембрантай холбогддог.
- Эцэст нь ДНХ-г мембран дээр бэхлэхийн тулд сүүлчийнх нь вакуумд 80 ° C-ийн температурт хоёр цагийн турш халааж эсвэл хэт ягаан туяагаар (нейлон мембраны хувьд) гэрэлтүүлдэг.
- Мэдэгдэж буй ДНХ-ийн дараалал бүхий цацраг идэвхт (флюресцент) шошготой дээжийг гибридизаци нь мембранаар хийгддэг.
- Эрлийзжүүлсний дараа илүүдэл дээжийг мембранаас угааж, эрлийзжүүлсэн бүтээгдэхүүнийг автортрадиографи (цацраг идэвхт дээжийн хувьд) эсвэл мембраны өнгийг (хромоген будгийн хувьд) үнэлдэг.
Үр дүн
Мембран дээр бэхлэгдсэн ДНХ-ийн тодорхой бүс бүхий дээжийг эрлийзжүүлэх нь дээжинд шинжлэгдсэн нуклеотидын дараалал байгааг илтгэнэ.
Өргөдөл
Хязгаарлалтын эндонуклеазаар эмчилсэн геномын ДНХ-ээр хийдэг Southern blotting-ийг тодорхойлоход ашиглаж болно. генийн хуулбарын тоогеномд. Хязгаарлалтын ферментээр таслагдаагүй зөвхөн нэг ДНХ-ийн фрагментийг эрлийзжүүлдэг датчик нь Southern blot дээр нэг тууз үүсгэдэг бол толбо дээрх олон тууз нь датчик нь олон ижил дараалалд эрлийзжсэнийг илтгэнэ. Эрлийзжүүлэлтийн нөхцлийн өөрчлөлт (эрлийзжүүлэлт хийх температурын өсөлт, давсны концентраци өөрчлөгдөх) нь өвөрмөц байдал нэмэгдэж, эрлийзжүүлэлт буурахад ойр боловч ижил биш дараалалд хүргэдэг.
"Өмнөд толбо" нийтлэлийн талаар сэтгэгдэл бичээрэй
Тэмдэглэл
Мөн үзнэ үү
| Альфа мушгиа | Энэ бол биохимийн талаархи нийтлэлийн төсөл юм. Та төсөл дээр нэмж тусалж чадна. |
Өмнөд толбыг тодорхойлсон ишлэл
– Үхэшгүй мөнх, хонгор минь... Зүгээр л үхэшгүй мөнх. Гэвч харамсалтай нь хэн нэгэн хүсээд л өгдөггүй гэдгийг ойлгохгүй байна. Хүн үнэ цэнтэй байх үед нь, бусдад өгөгддөггүй зүйлийг МЭДЭЭД, түүнийгээ бусад, зохистой хүмүүсийн тусын тулд ашиглахад л өгөгддөг... Энэ хүн түүн дээр амьдарч байгаа учраас дэлхий сайхан болох үед.- Тэр яагаад хэрэгтэй байна вэ, ээж ээ? Эцсийн эцэст, үхэшгүй байдал гэдэг нь хүн маш удаан амьдрах ёстой гэсэн үг үү? Мөн энэ нь маш хэцүү, тийм үү? Миний хувьд ч гэсэн богино амьдралХүн бүр олон алдаа гаргадаг, дараа нь тэр үүнийгээ цагаатгахыг оролддог, эсвэл засч залруулахыг хичээдэг ч чадахгүй ... Тэр яагаад үүнээс ч илүүг хийх ёстой гэж бодож байна вэ?..
Анна намайг цочирдуулсан!.. Бяцхан охин минь хэзээ насанд хүрсэн хүн шиг бүрэн сэтгэж сурсан бэ?.. Үнэн, амьдрал түүнд тийм ч өршөөлгүй, зөөлөн байгаагүй ч Анна маш хурдан өсч том болсон нь намайг баярлуулж, сандаргасан. тэр үед ... Би түүнийг өдөр бүр хүчирхэгжиж байгаад баярлаж байсан, тэр үед би түүнийг хэтэрхий бие даасан, бие даасан болох вий гэж айж байсан. Шаардлагатай бол түүнийг ямар нэг зүйлд итгүүлэх нь надад маш хэцүү байх болно. Тэрээр "хариуцлага"-аа үргэлж нухацтай авч, амьдрал, хүмүүсийг чин сэтгэлээсээ хайрлаж, хэзээ нэгэн цагт тэднийг аз жаргалтай, сэтгэл нь илүү цэвэр, үзэсгэлэнтэй болоход нь тусалж чадна гэдэгтээ маш их бахархдаг.
Одоо Анна жинхэнэ Муу-тай анх уулзлаа... Түүний маш эмзэг амьдралд хайр найргүй нэвтэрч, хайртай аавыг нь устгаж, намайг авч, өөртөө аймшигтай болно гэж заналхийлсэн... Тэгээд би түүнийг үнэхээр эргэлзэж байсан. Хэрэв түүний гэр бүл бүхэлдээ Караффагийн гарт үхвэл ганцаараа бүх зүйлтэй тэмцэх хангалттай хүч байсан уу?
Бидэнд оногдсон цаг дэндүү хурдан өнгөрөв. Караффа босгон дээр инээмсэглэн зогсож байв ...
Би орсон сүүлчийн удааБи хайртай охиноо одоо удаан, магадгүй хэзээ ч харахгүй гэдгээ мэдээд цээжиндээ тэврэв... Анна үл мэдэгдэх газар руу явж байсан бөгөөд Караффа түүнд үнэхээр зааж сургах хүсэлтэй байгаа гэдэгт найдаж байлаа. түүний галзуу хүмүүсийн зорилго, энэ тохиолдолд ядаж хэсэг хугацаанд түүнд юу ч заналхийлдэггүй. Одоогоор тэр Метеора хотод байх болно.
– Мадонна, яриа танд таалагдсан уу? – гэж Карафа чин сэтгэлээсээ дүр эсгэн асуув.
– Гэгээнтэн танд баярлалаа. Тийм ээ, мэдээж. Гэсэн хэдий ч би охиноо ердийн ертөнцөд заншил ёсоор өсгөж, танихгүй хүмүүсийн гарт өгөхгүй байхыг илүүд үздэг, учир нь танд ямар нэгэн төлөвлөгөө байгаа юм. Ганцхан айлын зовлон байхгүй биз дээ?
- За, аль нь байхаас шалтгаална, Исидора! - Караффа инээмсэглэв. – Дахин хэлэхэд “Гэр бүл” бас ГЭР БҮЛ гэж бий... Харин таных харамсалтай нь хоёрдугаар ангилалд багтдаг... Та боломжоо төлөхгүйгээр зүгээр л ингэж амьдрахад хэтэрхий хүчтэй, үнэ цэнэтэй юм. “Агуу шулам минь” минь, энэ амьдралд бүх зүйл өөрийн гэсэн үнэ цэнэтэй, та хүссэн хүсээгүй бүх зүйлийн төлөөсийг төлөх ёстой гэдгийг санаарай... Тэгээд харамсалтай нь та маш их төлөх ёстой болно. Гэхдээ өнөөдөр муу зүйлийн тухай ярихаа больё! Та цагийг маш сайхан өнгөрүүлсэн, тийм үү? Дараа уулзацгаая, Мадонна. Би чамд амлаж байна, удахгүй болно.
Би хөшиж орхив... Эдгээр үгс надад ямар их танил байсан бол!.. Энэ гашуун үнэн миний богинохон амьдралд маш олон удаа дагалддаг байсан бол би өөр хүнээс сонсож байгаа гэдэгтээ итгэж чадахгүй байв!.. Энэ үнэхээр тийм байсан байх. Хүн бүр төлөх ёстой байсан нь үнэн, гэхдээ хүн бүр сайн дураараа үүнийг хийдэггүй ... Тэгээд заримдаа энэ төлбөр хэтэрхий үнэтэй байдаг ...
Стелла миний хачин эргэлзэж байгааг анзаарсан бололтой гайхан нүүр рүү минь ширтэв. Гэвч би түүнд "бүх зүйл сайхан, бүх зүйл сайхан" гэдгийг шууд харуулж, хэсэг чимээгүй болсон Исидора тасалдсан түүхийг үргэлжлүүлэв.
Караффа миний хайртай хүүхдийг аваад явлаа. Бидний эргэн тойрон дахь ертөнцбүдгэрч, сүйрсэн зүрх минь дусал дуслаар хар, найдваргүй гунигтайгаар аажмаар дүүрэв. Ирээдүй нь аймшигтай санагдаж байв. Түүнд ямар ч найдвар байсангүй, одоо хичнээн хэцүү байсан ч эцэст нь бүх зүйл ямар нэгэн байдлаар бүтнэ, бүх зүйл сайхан болно гэсэн ердийн итгэл байсангүй.
Дуудлагын самбар бүхий домофон худалдаж аваарай.
Өмнөд толбо
Southern blotting аргыг ашигласан молекул биологидээжинд тодорхой ДНХ-ийн дарааллыг тодорхойлох. Southern blotting арга нь агароз гель электрофорезыг ДНХ-г фракцлах аргыг хослуулан уртаар тусгаарлагдсан ДНХ-ийг гибридизацийн мембран шүүлтүүрт шилжүүлэх арга техникийг ашигладаг. Энэ аргыг зохион бүтээгч, Английн биологич Эдвин Саутерн нэрээр нэрлэжээ.
Western blotting, Northern blotting, Southern blotting зэрэг бусад дамжуулах технологиуд нь ижил төстэй аргуудыг ашигладаг боловч дээжинд РНХ эсвэл уураг илрүүлэхэд ашигладаг бөгөөд эдгээрийг Southern-ийн зохион бүтээсэн аргын нэрээр нэрлэдэг. Southern blot нь эрдэмтний нэрээр нэрлэгдсэн тул нэр томьёог том үсгээр, Western blot болон Northern blot-ийг жижиг үсгээр бичдэг.
Арга
- Хязгаарлалтын эндонуклеазууд нь өндөр молекул жинтэй ДНХ-г жижиг хэсгүүдэд хуваасан.
- ДНХ-ийн хэсгүүдийг агароз гель дээр электрофорезжуулж, уртыг ялгана.
- Зарим ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд 15 кб-аас урт байвал гелийг шилжүүлэхийн өмнө боловсруулдаг, жишээлбэл. давсны хүчил, энэ нь ДНХ-ийн цэвэршилтийг үүсгэж, мембран руу шилжихэд тусалдаг.
- Шүлтлэг дамжуулах аргыг ашиглах үед агароз гель байрлуулна шүлтлэг уусмал, харин ДНХ-ийн давхар мушгиа нь денатурат болж сөрөг цэнэгтэй ДНХ-ийг эерэг цэнэгтэй мембрантай холбож цаашдын эрлийзжилтийг хөнгөвчилдөг. Үүний зэрэгцээ үлдсэн РНХ мөн устаж үгүй болдог.
- Нитроцеллюлозын мембраны хуудсыг агароз гель дээр эсвэл доод талд байрлуулна. Даралтыг гель дээр шууд эсвэл хэд хэдэн давхаргаар цаасаар хийдэг. Амжилттай шилжүүлэхийн тулд гель ба мембраны хооронд нягт холбоо барих шаардлагатай. Буферийг капиллярын хүчээр ус ихтэй газраас ус багатай газар руу зөөдөг. Энэ нь ДНХ-ийг гельээс мембран руу шилжүүлэх явдал юм. Полианионик ДНХ нь ион солилцооны харилцан үйлчлэлээр эерэг цэнэгтэй мембрантай холбогддог.
- Эцэст нь ДНХ-ийг мембран дээр бэхлэхийн тулд сүүлчийнх нь вакуумд 80 ° C-ийн температурт хоёр цагийн турш халааж эсвэл хэт ягаан туяагаар гэрэлтүүлдэг.
- Мэдэгдэж буй ДНХ-ийн дараалал бүхий цацраг идэвхт шошготой дээжийг гибридизаци нь мембранаар хийгддэг.
- Эрлийзжүүлсний дараа илүүдэл дээжийг мембранаас угааж, эрлийзжүүлсэн бүтээгдэхүүнийг автортрадиографаар дүрслэн харуулах эсвэл мембраны өнгийг үнэлдэг.
| Сурвалжлагч ген |
Тодорхой ген нь эс эсвэл эд эсийн дээжинд агуулагдах ДНХ эсвэл РНХ молекулын бусад олон сегментээс тухайн генд тохирох ДНХ эсвэл РНХ молекулуудын тодорхой сегментүүдийг ялгах чадварыг агуулдаг. Геномын ДНХ-г шинжлэх үед геномын ДНХ-ийг хязгаарлах ферментийн тусламжтайгаар задлах замаар олж авсан хэдэн сая фрагмент агуулсан нарийн төвөгтэй холимог дахь сонирхолтой ДНХ-ийн фрагментийг илрүүлэх, судлах нь асуудал юм. РНХ-ийн дээжийн хувьд зорилтот мРНХ нь 1000-д 1-ээс бага байгаа эд эсийн нийт РНХ дэх мРНХ-ийн тодорхой хуулбарын хэмжээ, чанарыг илрүүлэх, хэмжихэд тулгардаг сорилт юм. нийт тооРНХ хуулбарууд.
Шийдэл асуудлуудБусад олон тооны ховор дарааллыг илрүүлэхийн тулд гель электрофорез ашиглан ДНХ эсвэл РНХ молекулуудыг хэмжээгээр нь ялгаж, дараа нь сонирхож буй молекулыг тодорхойлох нуклеотидын датчикаар эрлийзжүүлнэ.
Өмнөд blotting техник(Southern blotting) нь хязгаарлах ферментийн тусламжтайгаар ДНХ-г боловсруулсны дараа олж авсан сая орчим хэлтэрхий бүхий мэдээлэлгүй мэт санагдах цуглуулгын сонирхлын олон хэлтэрхийг олж илрүүлэх, судлах боломжийг танд олгоно. 1970-аад оны дундуур боловсруулсан Southern blotting нь хязгаарлалтын ферментээр шингэсэн ДНХ-ийн тодорхой хэсгүүдийг судлах стандарт арга болжээ. Энэ процедур нь эхлээд боломжтой эх сурвалжаас ДНХ-г гаргаж авах явдал юм. Цөмгүй боловсорч гүйцсэн улаан эсийг эс тооцвол биеийн аль ч эсийг ДНХ-ийн эх үүсвэр болгон ашиглаж болно.
Дээжний шинжилгээний явцад ДНХӨвчтөн ихэвчлэн венийн цооролтоор олж авсан лимфоцитын геномын ДНХ-ийг ашигладаг. 10 мл захын цусанд ойролцоогоор 108 лейкоцит буюу 100 микрограмм ДНХ агуулагддаг бөгөөд энэ нь хязгаарлах ферментийн нөлөөгөөр хоол боловсруулахад хангалттай тун юм. Геномын ДНХ-ийг төрөхийн өмнөх оношлогоонд ашигладаг өсгөвөрлөсөн арьсны фибробластууд, амнион эсүүд эсвэл chorionic villi зэрэг бусад эдээс эсвэл янз бүрийн эрхтнүүдээс (жишээлбэл, элэг, бөөр, ихэс) эд эсийн биопсийн дээжээс авч болно.
Сая сая өөр фрагментүүдээр оролдож байна ДНХГеномын ДНХ-ийн дээжийг хязгаарлах ферментүүдээр ферментийн задралаар үүсгэсэн , эхлэлийн цэг дээр агароз гелийн гадаргуу дээр хэрэглэнэ. Дараа нь ДНХ-ийн хэсгүүдийг агароз гель электрофорез ашиглан хэмжээгээр нь ялгаж, жижиг хэсгүүд нь цахилгаан талбарт том хэсгүүдээс илүү хурдан хөдөлдөг. Сонирхсон ДНХ-ийг этидий бромид гэх мэт флюресцент будгаар будахад ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд нь гель доторх эгнээний дагуу тархсан флюресцент хэсгүүд, дээр нь жижиг хэсгүүд, доор нь том хэсгүүд гарч ирдэг. ДНХ нь гель дотор салангид тууз хэлбэрээр бус түрхэц хэлбэрээр харагдана, учир нь ихэвчлэн өөр өөр хэмжээтэй ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд нэг нэгнээсээ салгахад хэтэрхий олон байдаг.
Хоёр судалтай хэлтэрхийний толбо ДНХэхлээд хүчтэй шүлтээр денатуржуулж ДНХ-ийн хэлхээг салгав. Үүний үр дүнд нэг судалтай ДНХ молекулуудыг гельээс сүвэрхэг цаасан шүүлтүүрт шилжүүлдэг (иймээс аргын хоёр дахь нэр нь "Өмнөд шилжүүлэг").
Учир нь танихОлон сая хүмүүсийн дунд нэг буюу хэд хэдэн фрагментийг сонирхож байгаа тул шүүлтүүрийг давхар ДНХ молекулуудын хосолцоог дэмжих нөхцөлд нэмэлт нэг судалтай шошготой датчикаар өсгөвөрлөнө. Угаах замаар холбогдоогүй датчикуудыг зайлуулж, дараа нь холбогдсон цацраг идэвхт датчик бүхий шүүлтүүрийг гэрэл зургийн хальсанд буулгаж, датчик бэхэлсэн нэг буюу хэд хэдэн фрагментийн байрлалыг харуулдаг. Тиймээс анхны гель дээрх хүний ДНХ-ийн фрагмент бүрийн тодорхой цацраг идэвхт туузыг хальсан дээрээс харж болно.
Чадвар Өмнөд толбоЗондууд нь зөвхөн их хэмжээний устгалт эсвэл оруулга зэрэг хязгаарлалтын фрагментийн хэмжээнд хэмжигдэхүйц нөлөө үзүүлдэг согогийг илрүүлж чаддаг тул мутацийг тодорхойлох нь хязгаарлагдмал. Нэг буюу хэд хэдэн суурийг өөрчилдөг мутаци нь хязгаарлах ферментийг таних талбайг үүсгэх буюу устгахаас бусад тохиолдолд илрүүлж чадахгүй бөгөөд үүний үр дүнд датчикийн илрүүлсэн фрагментийн хэмжээ мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөнө. Гэсэн хэдий ч генийн нэг буюу хэд хэдэн суурь хосод нөлөөлж буй мутацийг илрүүлэх Southern blotting-ээс өөр олон аргууд байдаг.
ДНХ, РНХ эсвэл уурагуудыг салгасны дараа тэдгээрийг илрүүлэх болон гель дотор хийхэд хэцүү бусад үйлдлүүдэд зориулсан хатуу тулгуур руу шилжүүлэх ёстой. шилжүүлэх үйл явц хүргэж байна молекулуудын хөдөлгөөнгүй байдал , өөрөөр хэлбэл хөдөлгөөнгүй байдалд тогтсон гэж нэрлэдэг толбо (англи хэлээр - толбо ). Нейлон эсвэл нитроцеллюлозын мембраныг субстрат болгон ашигладаг.
Хөөх(Англи хэлнээс blotting - blotting) гэдэг нь нэг судалтай ДНХ-ийн молекулуудыг холбодог (хөдөлгөөнгүй болгодог) нитроцеллюлозоор хийсэн тусгай хальс (мембран) руу электрофорезийн ДНХ-ийн хэсгүүдийг шилжүүлэх арга юм.
Өмнөд толбо(санал болгосон зохиогчийн нэрийн дараа) нь хялгасан судасны нөлөөгөөр ДНХ-ийн хэсгүүдийн хөдөлгөөнд тулгуурладаг. Агароз гельд агуулагдах ДНХ-ийн хэсгүүдийг шүүлтүүрийн цаас ашиглан нитроцеллюлозын хальс руу шилжүүлэх үйл явц нь арчихтай төстэй.
Шинжилгээг дараах байдлаар гүйцэтгэнэ.
– Тусгаарлагдсан, цэвэршүүлсэн, денатуржуулсан, хуваагдсан ДНХ-ийг агароз гель дээр байрлуулж, хэсгүүдийг масс ба цэнэгээр электрофорезээр тусгаарладаг.
– Агароз гелийн хуудсыг төвлөрсөн давсны (буфер) уусмалаар чийгшүүлсэн шүүлтүүрийн цаасан дээр байрлуулна.
– Дараа нь гель дээр нитроцеллюлоз шүүлтүүрийг түрхэж, нэг судалтай ДНХ-ийн хэсгүүдийн хөдөлгөөнгүй байдал (эсвэл шингээх, бэхлэх) явагдана.
– Шүүлтүүрийн дээд талд хуурай шүүлтүүрийн цаас байрлуулсан бөгөөд энэ нь гельээр дамжин буферийн уусмалыг удаан урсгах боломжийг олгодог (өөрөөр хэлбэл, нэг төрлийн хялгасан судасны шахуургын үүрэг гүйцэтгэдэг). Давсны уусмал, агароз гель дамжин өнгөрч, нитроцеллюлозоор хадгалагдаж, түүнтэй холбогддог ДНХ-ийн хэсгүүдийг авч явдаг бөгөөд уусмалыг хуурай шүүлтүүр цаасаар шингээдэг.
– Дараа нь ДНХ-ийг шүлтээр денатуражуулж, шүүлтүүрийг 80 0 С-ийн температурт вакуумд байлгасны үр дүнд нэг судалтай ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд нитроцеллюлоз дээр эргэлт буцалтгүй хөдөлгөөнгүй (тогтмол) болдог. Энэ тохиолдолд хөдөлгөөнгүй ДНХ-ийн туузны байршил нь гель дэх байрлалтай яг таарч байна.
– Шүүлтүүртэй холбогдсон ДНХ-г ДНХ шошготой датчик бүхий уусмалд хийж, эрлийзжилт явагдана. Эрлийзжүүлэх (хэлбэр устөрөгчийн холбоо) тодорхой датчиктай бол зөвхөн нэмэлт ДНХ-ийн хэсгүүд байх бөгөөд үүнийг рентген хальсан дээр гэрлийн судал хэлбэрээр илрүүлж болно. нитроцеллюлоз шүүлтүүрийн авторентографи
Цэг толбо. Цэгэн толбо бэлтгэхийн тулд ДНХ эсвэл РНХ-ийн бэлдмэлийг шүүлтүүрт шууд хэрэглэнэ. Мансууруулах бодисын дуслууд нь шүүлтүүр дээрх цэгүүд шиг харагддаг бөгөөд энэ нь толбоны төрлийн нэрийг тайлбарладаг (Англи: цэг). 1) Хэт авиан шинжилгээгээр урьдчилан боловсруулсан геномын ДНХ-ээс 5-10 хос нуклеотидын урт хэсгүүд үүсдэг.
2) ДНХ эсвэл РНХ датчикийг датчикт ашиглах боломжтой болгохын тулд тэдгээрийг денатураци хийх шаардлагатай, i.e. нэг гинжин хэлбэрт шилжүүлэх. Энэ нь 100 ° C-ийн температурын нөлөөн дор тохиолддог.
3) Денатуратжуулсан нуклейн хүчлүүдийг мөсөн дээр өсгөвөрлөнө: температурын огцом бууралт нь тэдний нөхөн төлжилтөөс сэргийлдэг, өөрөөр хэлбэл. гинжний нэмэлт хослол. Денатуратлагдсан ДНХ эсвэл РНХ-ийг шүүлтүүрт шууд түрхэж, датчик агуулсан уусмалд өсгөвөрлөнө.
4) Шинжилсэн нуклейн хүчлийг уусмалд оруулахгүйн тулд шүүлтүүр (мембран) дээр бэхэлсэн байх ёстой. Үүний тулд нитроцеллюлоз ба нейлон гэсэн хоёр төрлийн шүүлтүүрийг ашигладаг.
Хөдөлгөөнгүй болгохын тулд нуклейн хүчилнитроцеллюлоз шүүлтүүр дээр хайруулын тавган дээр 80 хэмд вакуум, нейлон шүүлтүүр дээр хэт ягаан туяаны цацрагийг 3-5 минутын турш хэрэглэнэ.
5) Нуклейн хүчлийн бэлдмэлийг изотопоор тэмдэглэсэн датчикаар инкубацласны дараа цацраг идэвхт бус аргуудыг ашиглан тусгай кассет эсвэл танихад авторентгенографи хийдэг.
Цэгийг арилгах нь зөвхөн нэг асуултанд хариулах боломжийг олгодог: өгөгдсөн дээжинд хүссэн нуклеотидын дараалал байгаа эсэх.
Хойд толбоны шинжилгээхамаарна:
1) РНХ-г тусгаарлах, шинжлэх (жишээлбэл, өгөгдсөн генээс уншсан мРНХ нь тухайн эсийн төрөлд байгаа эсэх, тухайлбал, ген нь илэрхийлэгдэж байгаа эсэхийг тодорхойлох);
2) энэ РНХ-ийн хэмжээ, тухайн эсийн төрлийг хөгжүүлэхэд түүний өөрчлөлтийг тодорхойлох;
3) генийн хуулбарын хэмжээг тодорхойлох.
Энэ тохиолдолд эсээс тусгаарлагдсан РНХ молекулуудыг гель электрофорез ашиглан хэмжээгээр нь ялгаж, дараа нь шүүлтүүрт шилжүүлнэ. Шошготой нэг судалтай датчикаар эрлийзжүүлсний дараа РНХ болон датчикийг эрлийзжүүлэх (гомологи) газрыг тодорхойлно.
Хэрэв хүссэн генийн (эсвэл мРНХ) нуклеотидын дараалал тодорхойгүй, харин түүний нийлэгжилтийг удирддаг уураг нь мэдэгдэж байгаа бол бага хэмжээний цэвэр уургийг ялгаж, заримынх нь амин хүчлийн дарааллыг тодорхойлох боломжтой (мэдлэг). 5-6 амин хүчлийн үлдэгдэл хангалттай). Хүснэгтийг ашиглах генетикийн код, өгөгдсөн амин хүчлийн дарааллыг кодлодог мРНХ (эсвэл ген өөрөө) хэсэгт бүх боломжит нуклеотидын дарааллыг тогтоох боломжтой. Энэ тохиолдолд генийн сангаас хүссэн клоныг хайж олохын тулд датчикийг нэгтгэж болно.
Вестерн блоттинГ(дархлааны цахилгаан, уураг арилгах) нь өвөрмөц уургийг тодорхойлох арга юм. Энэ нь өндөр өвөрмөц эсрэгтөрөгч ба эсрэгбиеийн харилцан үйлчлэлийн үзэгдэл дээр суурилдаг. Тиймээс эсрэгтөрөгч (зорилтот) нь тодорхойлж буй уураг бөгөөд датчик нь түүний эсрэгбие юм.
Судалгаанд хамрагдсан уургийн эсрэгбиемүүдийг олж авдаг янз бүрийн аргаар. Хамгийн энгийн нь лабораторийн амьтны (ихэвчлэн туулай) цусны урсгал руу цэвэршүүлсэн уургийн дээжийг тарих явдал юм. Түүний бие нь энэ гадаад уургийн эсрэгбие (иммуноглобулин) үүсгэдэг. Эдгээр нь зорилтот уурагтай харилцан үйлчлэх үндсэн эсрэгбие юм.
Гэсэн хэдий ч эсрэгбиеийн өгөгдөлд таних шошгыг шууд нэвтрүүлэх нь практик биш байх болно. Өөр өөр уургийг тодорхойлохын тулд өөр өөр эсрэгбиемүүдийг шошголох шаардлагатай бөгөөд ингэснээр өөр өөр байдаг өндөр өртөгтэй. Энэ нь ашиглахад илүү үндэслэлтэй болсон бүх нийтийн эсрэгбие – хавсарсан антииммуноглобулинууд, эдгээр нь үндсэндээ тодорхойлсон уургийг эсрэгтөрөгч болгон ашиглах замаар үүссэн эсрэгбиемүүдийн эсрэгбие юм. Жишээлбэл, туулайнд нийлэгжсэн бүх иммуноглобулинтай Ig-тэй хавсарсан иммуноглобулинууд өөр өөр эсрэгтөрөгчтэй харилцан үйлчилнэ. Тиймээс яг ийм бүх нийтийн хоёрдогч эсрэгбие нь изотоп эсвэл цацраг идэвхт бус шошготой байдаг. Хэд хэдэн урвалын явцад уусдаггүй өнгөт нэгдэл үүсэхэд хүргэдэг изотопын бус шошгооос гадна (нуклейн хүчлийг арилгахтай адил) өндөр мэдрэмжтэй химилюминесцент шошго нь маш их байдаг. ихэвчлэн ашигладаг.
1) Гомогенатаас уураг гаргаж авах
2) SDS-полиакриламидын гель электрофорез (PAGE) ашиглан уургийг молекулын жингээр ялгах. SDS электрофорезийн арга нь уугуул уургийн денатурацийг агуулдаг. Тиймээс уургийн молекулууд ижил байдаг молекул жин, гель дэх ижил замыг туулж, туузан хэлбэрээр жагсана. Холимог нь янз бүрийн хэмжээтэй уургийн молекулуудыг агуулдаг тул олон тууз үүсдэг. Электрофорезын үр дүнг уургийн будалтаар (Coomassie гялалзсан хөх, амидо хар, мөнгөн будалт) харж болно. Мөнгөний будалт нь өвөрмөц мэдрэмжтэй тул үүссэн туузан дахь 0.1 нг уураг илрүүлэх боломжийг олгодог. Энэ нь гель дээр түрхсэн уургийн хэмжээг хянахад маш чухал юм.
3) Уургийг гельээс мембран руу шилжүүлэх. Полиакриламид нь том иммуноглобулины молекулуудыг уураг руу тараахыг зөвшөөрдөггүй тул үүнийг хийдэг. Мөн мембран дээр хөдөлгөөнгүй уураг нь эсрэгбиемүүдэд хүртээмжтэй болдог. Нуклейн хүчлийг арилгахаас ялгаатай нь уургийн мембран руу шилжих нь цахилгаан хүчний нөлөөн дор явагддаг, жишээлбэл. цахилгаан талбарт.
4) Үүссэн толбо нь уургийн эсрэг ийлдэс, дараа нь антииммуноглобулинуудаар өсгөвөрлөнө. Үр дүнг ашигласан шошгоны төрлөөс хамааруулан харуулна.
Хязгаарлалт:
1) судалж буй хэсгүүдийн том хэмжээ нь ДНХ датчикийн уртаас ихээхэн давж, шууд молекулын шинжилгээ хийхээс сэргийлдэг;
2) ДНХ-ийн анхны молекулд харгалзах хязгаарлалтын газрууд байгаа эсэхээс хамаарч судлагдсан дарааллын төгсгөлийг дур зоргоороо сонгох боломжгүй байх;
3) их хэмжээний сайн цэвэршүүлсэн өндөр молекул жинтэй геномын ДНХ-ийн хэрэгцээ (нэг урвалд дор хаяж 10 мкг, энэ нь 0.5-1 мл цустай тэнцэх),
4) геномын эрлийзжүүлэлтийн хувьд - 109 импульс/мин * мкг-аас багагүй өндөр өвөрмөц идэвхжил бүхий цацраг идэвхт ДНХ-ийн мэдрэгч, хязгаарлагдмал хугацаанд ажилладаг, тусгайлан тоноглогдсон изотопын нэгж байгаа эсэх. Нэмж дурдахад, гарын үсгийг удаан хугацаагаар харуулах нь үр дүнд хүрэх хугацааг ихээхэн уртасгадаг.
5) хөдөлмөрийн өндөр эрчимжилт судалгаа
