Alte tehnologii de transfer (blotting), cum ar fi Western blotting, Northern blotting, Southern blotting, folosesc metode similare, dar pentru a detecta ARN-ul sau proteina într-o probă și sunt numite după metoda inventată de Southern. Deoarece Southern blot este numit după om de știință, termenul este scris cu literă majusculă, în timp ce Western blot și Northern blot sunt scrise cu literă mică.

Metodă

1. Endonucleazele de restricție taie ADN-ul cu greutate moleculară mare în fragmente mai mici.
2. Fragmentele de ADN sunt supuse electroforezei pe un gel de agaroză pentru separarea lungimii.
3. În cazul în care unele fragmente de ADN sunt mai lungi de 15 kb, înainte de transfer gelul este tratat, de exemplu, cu acid clorhidric, care determină depurinarea ADN-ului și facilitează transferul pe membrană.
4. Când se utilizează metoda de transfer alcalin, gelul de agaroză este plasat într-o soluție alcalină, care denaturează dubla helix ADN și facilitează legarea ADN-ului încărcat negativ de membrana încărcată pozitiv pentru hibridizare ulterioară. În acest caz, ARN-ul rămas este de asemenea distrus.
5. O foaie de membrană de nitroceluloză (sau nailon) este plasată deasupra sau inferioară a gelului de agaroză. Presiunea este aplicată direct pe gel sau prin mai multe straturi de hârtie. Pentru un transfer reușit, este necesar un contact strâns între gel și membrană. Tamponul este transportat prin forțe capilare dintr-o zonă cu conținut ridicat de apă într-o zonă cu conținut scăzut de apă (membrană). Aceasta implică transferul ADN-ului din gel în membrană. ADN-ul polianionic se leagă de membrana încărcată pozitiv prin interacțiuni de schimb ionic.
6. Pentru a fixa în final ADN-ul pe membrană, aceasta din urmă este încălzită în vid la o temperatură de 80 °C timp de două ore sau iluminată cu radiații ultraviolete (în cazul membranelor de nailon).
7. Hibridizarea unei probe marcate radioactiv (fluorescent) cu o secvență de ADN cunoscută se realizează cu o membrană.
8. După hibridizare, proba în exces este spălată de pe membrană și produsele de hibridizare sunt vizualizate prin autoradiografie (în cazul unei probe radioactive) sau se apreciază culoarea membranei (în cazul colorației cromogenice).

Rezultate

Hibridizarea unei probe cu o regiune specifică de ADN fixată pe membrană indică prezența secvenței de nucleotide analizate în probă.

Aplicație

Southern blot, care se realizează cu ADN genomic tratat cu endonucleaze de restricție, poate fi utilizat pentru a determina numerele de copii ale genelorîn genom. O sondă care hibridizează doar la un singur fragment de ADN care nu a fost tăiat de enzimele de restricție va produce o singură bandă pe un Southern blot, în timp ce mai multe benzi de pe blot indică faptul că sonda s-a hibridizat la mai multe secvențe identice. Modificările condițiilor de hibridizare (creșterea temperaturii la care se realizează hibridizarea, modificarea concentrației de sare) duc la o creștere a specificității și o scădere a hibridizării cu secvențe apropiate, dar nu identice.

Scrieți o recenzie despre articolul „Southern blot”

Note

Vezi de asemenea

Helix alfa

Acesta este un proiect de articol despre biochimie. Puteți ajuta proiectul adăugând la el.

Extras care caracterizează Southern blot

– Nemurire, dragă... Doar nemurire. Dar, din păcate, nu înțelege că nu este dat pur și simplu pentru că cineva o dorește. Se dă atunci când o persoană merită, când ȘTIE ce nu este dat altora și îl folosește în folosul altor oameni demni... Când Pământul devine mai bun pentru că această persoană trăiește pe el.
- De ce are nevoie, mamă? La urma urmei, nemurirea este atunci când o persoană trebuie să trăiască foarte mult timp? Și asta este foarte greu, nu-i așa? Chiar și pentru a mea viata scurta toată lumea face multe greșeli, pe care apoi încearcă să le ispășească sau să le corecteze, dar nu poate... De ce crede că ar trebui lăsat să facă și mai multe dintre ele?..
Anna m-a șocat!.. Când a învățat fiica mea să gândească complet ca un adult?.. Adevărat, viața nu a fost prea milostivă sau blândă cu ea, dar, cu toate acestea, Anna a crescut foarte repede, ceea ce m-a făcut fericit și alarmat de în același timp... M-am bucurat că pe zi ce trece ea devenea mai puternică și, în același timp, îmi era teamă că foarte curând va deveni prea independentă și independentă. Și îmi va fi foarte greu, dacă va fi nevoie, să o conving de ceva. Și-a luat întotdeauna „responsabilitățile” de Înțelept foarte în serios, iubind viața și oamenii din toată inima și simțindu-se foarte mândră că într-o zi îi va putea ajuta să devină mai fericiți, iar sufletul lor mai curat și mai frumos.
Și acum Anna s-a întâlnit pentru prima dată cu adevăratul Rău... Care a izbucnit fără milă în viața ei foarte fragilă, distrugându-și iubitul tată, luându-mă și amenințănd că va deveni o groază pentru ea însăși... Și nu eram sigur dacă ea a avut destulă putere să lupte singur cu totul în cazul în care întreaga ei familie moare din mâna lui Caraffa?...
Ora alocată nouă a trecut prea repede. Caraffa stătea în prag, zâmbind...
sunt înăuntru ultima dată Mi-am strâns iubita fata la piept, știind că nu o voi vedea acum foarte mult timp, și poate chiar niciodată... Anna pleca spre necunoscut și nu puteam decât să sper că Caraffa chiar vrea să o învețe. pentru nebunii lui obiective și în acest caz, cel puțin de ceva vreme, nimic nu o amenință. Deocamdată va fi la Meteora.
– Ți-a plăcut conversația, Madonna? – a întrebat Caraffa prefăcând cu sinceritate.
— Mulțumesc, Sfinția Voastră. Da, desigur. Deși, aș prefera să-mi cresc singur fiica, așa cum se obișnuiește în lumea normală, și să nu o dau în mâinile unor oameni necunoscuți, doar pentru că ai un fel de plan pentru ea. Nu este suficientă durere pentru o singură familie, nu crezi?
- Păi depinde care, Isidora! – Karaffa a zâmbit. – Din nou, există „familie” și FAMILIE... Și a ta, din păcate, aparține categoriei a doua... Ești prea puternic și valoros ca să trăiești așa fără să-ți plătești oportunitățile. Ține minte, „marea Vrăjitoare” a mea, totul în această viață are prețul lui și trebuie să plătești pentru tot, indiferent dacă îți place sau nu... Și, din păcate, va trebui să plătești foarte scump. Dar să nu vorbim despre lucruri rele astăzi! Te-ai distrat minunat, nu-i așa? Ne vedem mai târziu, Madonna. Îți promit, va fi foarte curând.
Am încremenit... Cât de familiare îmi erau aceste cuvinte!.. Acest adevăr amar m-a însoțit atât de des în viața mea încă scurtă, încât nu-mi venea să cred că le aud de la altcineva!.. Probabil asta a fost într-adevăr. adevărat că toată lumea trebuia să plătească, dar nu toată lumea a făcut-o de bunăvoie... Și uneori această plată era prea scumpă...
Stella s-a uitat în fața mea surprinsă, aparent observând ciudata mea confuzie. Dar i-am arătat imediat că „totul e bine, totul e bine”, iar Isidora, care a tăcut o clipă, și-a continuat povestea întreruptă.
Caraffa a plecat, luându-mi copilul drag. Lumea din jurul nostru s-a stins, iar inima mea devastată, picătură cu picătură, s-a umplut încet de melancolie neagră, fără speranță. Viitorul părea de rău augur. Nu era nicio speranță în el, nu exista o încredere obișnuită că, oricât de greu ar fi acum, până la urmă totul va merge cumva și totul va fi cu siguranță bine.

Cumpărați interfoane cu panou de apelare.

Southern blot

Metoda Southern blotting utilizată în biologie moleculară pentru a identifica o secvență specifică de ADN dintr-o probă. Metoda Southern blotting combină electroforeza pe gel de agaroză pentru a fracționa ADN-ul cu tehnici de transfer a ADN-ului separat pe lungime pe un filtru de membrană pentru hibridizare. Metoda poartă numele inventatorului său, biologul englez Edwin Southern.

Alte tehnologii de transfer, cum ar fi Western blotting, Northern blotting, Southern blotting, folosesc metode similare, dar pentru a detecta ARN-ul sau proteinele într-o probă și sunt numite după metoda inventată de Southern. Deoarece Southern blot este numit după om de știință, termenul este scris cu literă majusculă, în timp ce Western blot și Northern blot sunt scrise cu literă mică.

Metodă

1. Endonucleazele de restricție taie ADN-ul cu greutate moleculară mare în fragmente mai mici.
2. Fragmentele de ADN sunt supuse electroforezei pe un gel de agaroză pentru separarea lungimii.
3. În cazul în care unele fragmente de ADN sunt mai lungi de 15 kb, gelul este procesat înainte de transfer, de ex. acid clorhidric, care determină depurinarea ADN-ului și facilitează transferul către membrană.
4. Când se folosește metoda de transfer alcalin, se introduce gelul de agaroză soluție alcalină, în timp ce dubla helix ADN denaturează și facilitează legarea ADN-ului încărcat negativ la o membrană încărcată pozitiv pentru hibridizare ulterioară. În același timp, ARN-ul rămas este și el distrus.
5. O foaie de membrană de nitroceluloză este plasată deasupra sau inferioară a gelului de agaroză. Presiunea este aplicată direct pe gel sau prin mai multe straturi de hârtie. Pentru un transfer reușit, este necesar un contact strâns între gel și membrană. Tamponul este transportat prin forțe capilare dintr-o zonă cu conținut ridicat de apă într-o zonă cu conținut scăzut de apă. Aceasta implică transferul ADN-ului din gel în membrană. ADN-ul polianionic se leagă de membrana încărcată pozitiv prin interacțiuni de schimb ionic.
6. Pentru a fixa în final ADN-ul pe membrană, aceasta din urmă este încălzită în vid la o temperatură de 80 °C timp de două ore sau iluminată cu radiații ultraviolete.
7. Hibridizarea unei probe marcate radioactiv cu o secvență de ADN cunoscută se realizează cu o membrană.
8. După hibridizare, excesul de probă este spălat de pe membrană și produsele de hibridizare sunt vizualizate prin autoradiografie sau se evaluează culoarea membranei.

Gena reporterului

O genă specifică implică capacitatea de a distinge segmente specifice de molecule de ADN sau ARN corespunzătoare acelei gene dintre multe alte segmente de molecule de ADN sau ARN prezente într-o probă de celule sau țesut. Atunci când este analizat ADN-ul genomic, provocarea este de a detecta și studia fragmentul de ADN specific de interes într-un amestec complex care conține câteva milioane de fragmente obținute prin digestia ADN-ului genomic cu enzime de restricție. Cu mostrele de ARN, provocarea este de a detecta și măsura volumul și calitatea unei anumite copii de ARNm în ARN total al unui țesut în care ARNm țintă este mai mic de 1 din 1000. numărul total copii ARN.

Soluţie probleme detectarea unei secvențe rare printre multe altele implică utilizarea electroforezei pe gel pentru a separa moleculele de ADN sau ARN după dimensiune, urmată de hibridizare cu o sondă de nucleotide care identifică molecula de interes.

Tehnica Southern blot(Southern blotting) vă permite să detectați și să studiați la un nivel aproximativ multe fragmente de interes într-o colecție aparent neinformativă de aproximativ un milion de fragmente obținute după procesarea ADN-ului cu enzime de restricție. Southern blotting, dezvoltat la mijlocul anilor 1970, a devenit metoda standard pentru examinarea fragmentelor specifice de ADN care au fost digerate de enzimele de restricție. Această procedură implică mai întâi extragerea ADN-ului dintr-o sursă disponibilă. Orice celulă din organism poate fi folosită ca sursă de ADN, cu excepția globulelor roșii mature care nu au nucleu.

În timpul analizei probei ADN Pacientul folosește de obicei ADN genomic al limfocitelor obținute prin puncție venoasă de rutină. 10 ml de sânge periferic conțin aproximativ 108 leucocite sau aproximativ 100 micrograme de ADN - o doză suficientă pentru digestia prin enzime de restricție. ADN-ul genomic poate fi obținut și din alte țesuturi, inclusiv fibroblaste cutanate cultivate, celule amniotice sau vilozități coriale, care sunt utilizate pentru diagnosticul prenatal, sau dintr-o probă de biopsie de țesut din diferite organe (de exemplu, ficat, rinichi, placentă).

Încercați cu milioane de fragmente diferite ADN, generate de digestia enzimatică a unei probe de ADN genomic cu enzime de restricție, sunt aplicate pe suprafața unui gel de agaroză la punctul de plecare. Fragmentele de ADN sunt apoi separate după dimensiune folosind electroforeza pe gel de agaroză, în care particulele mici se mișcă mai repede decât cele mai mari într-un câmp electric. Atunci când ADN-ul de interes, astfel separat, este colorat cu un colorant fluorescent precum bromură de etidio, fragmentele de ADN apar ca zone fluorescente distribuite de-a lungul benzii în gel, fragmente mai mici deasupra, altele mai mari dedesubt. ADN-ul apare în gel mai degrabă ca un frotiu decât ca benzi discrete, deoarece există de obicei prea multe fragmente de ADN de dimensiuni diferite pentru a se separa unul de altul.

Pată de fragmente dublu catenare ADN mai întâi denaturat cu un alcali puternic pentru a separa catenele de ADN. Moleculele de ADN monocatenar rezultate sunt apoi transferate din gel pe filtre de hârtie poroasă (de unde și al doilea nume al metodei - „Transferul sudic”).

Pentru identificare unul sau mai multe fragmente de interes printre milioane de altele, filtrul este incubat cu o sondă marcată monocatenar complementară în condiții care promovează împerecherea moleculelor duble de ADN. Sondele nelegate sunt îndepărtate prin spălare, apoi filtrul cu sonde radioactive legate este expus unui film fotografic, care dezvăluie poziția unuia sau mai multor fragmente de care s-a atașat sonda. Astfel, benzile radioactive specifice pentru fiecare fragment de ADN uman de interes pe gelul original pot fi văzute pe film.

Abilitatea Southern blot identificarea mutațiilor este limitată deoarece sondele pot detecta doar defecte care au un efect măsurabil asupra dimensiunii fragmentului de restricție, cum ar fi ștergerile sau inserțiile mari. O mutație care schimbă una sau mai multe baze nu poate fi detectată decât dacă creează sau distruge un situs de recunoaștere a enzimei de restricție, rezultând o schimbare semnificativă a dimensiunii fragmentului detectat de sondă. Cu toate acestea, există multe metode, altele decât Southern blot, pentru a detecta mutațiile care afectează una sau mai multe perechi de baze dintr-o genă.

Odată ce ADN-ul, ARN-ul sau proteinele sunt separate, acestea trebuie transferate pe un suport solid pentru detectare și alte operații care sunt dificil de făcut într-un gel. Procesul de transfer care duce la imobilizarea moleculelor , adică fixat în stare staționară se numește ştergerea (în limba engleză - ştergerea ). Ca substrat se folosesc membrane de nailon sau nitroceluloză.

Btingerea(din engleză blotting - blotting) este o metodă de transfer a fragmentelor de ADN electroforetic pe o peliculă (membrană) specială din nitroceluloză care leagă (imobilizează) moleculele de ADN monocatenar.

Southern blot(după numele autorului care a propus-o) se bazează pe mișcarea fragmentelor de ADN datorită efectului capilar. Procesul de transfer al fragmentelor de ADN conținute într-un gel de agaroză pe o peliculă de nitroceluloză folosind hârtie de filtru este similar cu blotarea.

Analiza se realizează după cum urmează:

– ADN-ul izolat, purificat, denaturat și fragmentat este plasat pe o foaie de gel de agaroză, unde fragmentele sunt separate electroforetic după masă și sarcină.

– O foaie de gel de agaroză se pune pe hârtie de filtru umezită cu soluție salină concentrată (tampon).

– Apoi se aplică pe gel un filtru de nitroceluloză, unde are loc imobilizarea (sau adsorbția, sau fixarea) fragmentelor de ADN monocatenar.

– Un teanc de foi de hârtie de filtru uscată este plasat deasupra filtrului, ceea ce asigură o curgere lentă a soluției tampon prin gel (adică, servește ca un fel de pompă capilară). Soluție salină, trecând printr-un gel de agaroză, poartă cu el fragmente de ADN care sunt reținute de nitroceluloză și se leagă de aceasta, iar soluția este absorbită de hârtie de filtru uscată.

– În continuare, ADN-ul este denaturat cu alcali, iar filtrul se menține în vid la o temperatură de 80 0 C, în urma căreia fragmentele de ADN monocatenar sunt imobilizate (fixate) ireversibil pe nitroceluloză. În acest caz, locația benzilor de ADN imobilizate corespunde exact cu locația lor în gel.

– ADN-ul legat de filtru este plasat într-o soluție cu o sondă marcată cu ADN, în care are loc hibridizarea. Hibridizare (form legături de hidrogen) cu o sondă specifică vor exista doar fragmente de ADN complementare acesteia, care pot fi detectate sub formă de dungi luminoase pe film cu raze X, adică. autoradiografia unui filtru de nitroceluloză

Ștergerea punctelor. Pentru a pregăti dot blots, un preparat ADN sau ARN este aplicat direct pe filtru. Picăturile de medicament arată ca niște puncte pe filtru, ceea ce explică numele tipului de blotting (în engleză: punct). 1) Din ADN genomic pretratat cu ultrasunete se formează fragmente lungi de 5–10 perechi de nucleotide.

2) Pentru a face sondele ADN sau ARN accesibile sondei, acestea trebuie denaturate, de exemplu. convertiți în formă cu un singur lanț. Acest lucru se întâmplă sub influența unei temperaturi de 100 °C.

3) Acizii nucleici denaturați sunt incubați pe gheață: o scădere rapidă a temperaturii împiedică renaturarea lor, i.e. pereche complementară de lanțuri. ADN-ul sau ARN-ul denaturat se aplică direct pe filtru, care este incubat într-o soluție care conține sonda.

4) Pentru a preveni intrarea în soluție a acidului nucleic analizat, acesta trebuie fixat pe un filtru (membrană). Pentru aceasta se folosesc doua tipuri de filtre: nitroceluloza si nailon.

Pentru imobilizare acizi nucleici pe un filtru de nitroceluloză se folosește prăjirea la 80 °C în vid, iar pe un filtru de nailon se folosește iradierea UV timp de 3–5 minute.

5) După incubarea preparatului de acid nucleic cu o sondă marcată cu izotop, autoradiografia se efectuează într-o casetă specială sau identificarea folosind metode neradioactive.

Dot blotting vă permite să răspundeți la o singură întrebare: dacă secvența de nucleotide dorită este prezentă într-o probă dată.

Analiza Northern blot se aplica:

1) pentru a izola și analiza ARN (de exemplu, pentru a determina dacă ARNm citit dintr-o anumită genă este prezent într-un anumit tip de celulă, adică dacă gena este exprimată sau nu);

2) pentru a determina cantitatea acestui ARN și modificările sale în dezvoltarea unui anumit tip de celulă;

3) pentru a determina dimensiunea unei transcriere a unei gene.

În acest caz, moleculele de ARN izolate din celulă sunt separate după dimensiune folosind electroforeză pe gel și apoi transferate într-un filtru. După hibridizare cu o sondă monocatenar marcată, sunt identificate situsurile de hibridizare (omologie) ale ARN-ului și ale sondei.

Dacă nu se cunoaște secvența de nucleotide a genei (sau ARNm) dorite, dar se cunoaște proteina a cărei sinteză o controlează, atunci este posibil să izolați o cantitate mică de proteină pură și să determinați secvența de aminoacizi a unora dintre acestea (cunoștințe). de 5–6 resturi de aminoacizi este suficient). Folosind masa cod genetic, este posibil să se stabilească toate secvențele de nucleotide posibile în secțiunea de ARNm (sau gena însăși) care codifică o anumită secvență de aminoacizi. În acest caz, o sondă poate fi sintetizată pentru a căuta clonele dorite într-o bibliotecă de gene.

Western blotinG(imunoelectroblotting, protein blotting) este o metodă de identificare a proteinelor unice. Se bazează pe fenomenul de interacțiune antigen-anticorp foarte specific. Astfel, antigenul (ținta) este proteina care se determină, iar sonda este anticorpul la aceasta.

Se obțin anticorpi la proteina studiată în diverse moduri. Cel mai simplu este să injectați o probă de proteină purificată în sângele unui animal de laborator (de obicei un iepure). Corpul său produce anticorpi (imunoglobuline) la această proteină străină. Aceștia sunt anticorpi primari care vor interacționa cu proteina țintă.

Cu toate acestea, nu ar fi rațional să se introducă o etichetă de identificare direct în datele despre anticorpi. Identificarea diferitelor proteine ​​ar necesita diferiți anticorpi să fie marcați, rezultând diferiți cost ridicat. Sa dovedit a fi mai rezonabil de utilizat anticorpi universali – antiimunoglobuline conjugate, care sunt în esență anticorpi la anticorpi produși prin utilizarea proteinei identificate ca antigen. De exemplu, anti-imunoglobulinele conjugate la Ig de iepure vor interacționa cu toate imunoglobulinele sintetizate la iepuri la diferiți antigeni. Astfel, tocmai astfel de anticorpi secundari universali sunt cei care poartă o etichetă izotopică sau neradioactivă. Pe lângă o etichetă non-izotopică, care în cursul mai multor reacții duce la formarea unui compus colorat insolubil (ca în cazul blotting-ului cu acid nucleic), o etichetă chemiluminiscentă, care are o sensibilitate mai mare, este foarte des folosit.

1) Extragerea proteinelor din omogenat

2) Separarea proteinelor în funcție de greutatea moleculară folosind electroforeză în gel de poliacrilamidă SDS (PAGE). Metoda de electroforeză SDS implică denaturarea proteinelor native. Astfel, moleculele proteice care au aceleași greutate moleculară, vor parcurge același drum în gel și se vor alinia sub forma unei benzi. Deoarece amestecul conține molecule de proteine ​​de diferite dimensiuni, se formează multe benzi. Rezultatele electroforezei pot fi vizualizate prin colorare cu proteine ​​(Coomassie brilliant blue, amido black, silver coloring). Colorarea cu argint are o sensibilitate unică care permite detectarea a cât mai puțin de 0,1 ng de proteină în banda rezultată. Acest lucru este foarte important pentru a controla cantitatea de proteine ​​aplicată pe gel.

3) Transferul proteinelor din gel pe membrană. Acest lucru se realizează deoarece poliacrilamida nu permite moleculelor mari de imunoglobuline să difuzeze în proteină. Și proteina imobilizată pe membrană devine accesibilă anticorpilor. Spre deosebire de blotarea acidului nucleic, transferul de proteine ​​către membrană are loc sub influența forțelor electrice, adică. într-un câmp electric.

4) Pata rezultată este incubată cu antiser la proteină și apoi cu antiimunoglobuline. Rezultatul este vizualizat în funcție de tipul de etichetă utilizat.

Restrictii:

1) dimensiunea mare a fragmentelor studiate, depășind semnificativ lungimea sondelor ADN și împiedicând analiza moleculară directă;

2) imposibilitatea alegerii arbitrare a capetelor secvenţelor studiate, determinată de prezenţa situsurilor de restricţie corespunzătoare în molecula originală de ADN;

3) necesitatea unei cantități mari de ADN genomic cu greutate moleculară mare bine purificat (cel puțin 10 μg per reacție, ceea ce este echivalent cu 0,5-1 ml de sânge),

4) pentru hibridizare genomică - prezența sondelor ADN radioactive cu activitate specifică mare de cel puțin 109 impulsuri/min * µg), care funcționează pentru o perioadă limitată de timp, și o unitate izotopică special echipată. În plus, expunerea prelungită a autografelor prelungește semnificativ timpul de obținere a rezultatelor.

5) intensitate mare a muncii cercetare