Генетика бактерий и вирусов.
Формирование новых знаний. Лекционный блок
План изучения темы:
1. Генетический материал бактерий.
2. Классификация и биологическая роль плазмид.
3.Генетика вирусов
4. Биотехнология, генетическая инженерия.
5.Противомикробные препараты
Молекулярная биология, изучающая фундаментальные основы жизни, является в значительной степени детищем микробиологии. В качестве базовых объектов изучения в ней используют вирусы и бактерии, а основное направление - молекулярная генетика основана на генетике бактерий и фагов.
Бактерии - удобный материал для генетики. Их отличает :
Относительная простота генома (сопокупности нуклеотидов хромосом);
Гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;
Различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК;
Половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток;
Легкость культивирования, быстрота накопления биомасс.
Общие представления о генетике.
Ген- уникальная структурная единица наследственности, носитель и хранитель жизни. Он имеет три фундаментальные функции.
1.Непрерывность наследственности - обеспечивается механизмом репликации ДНК.
2.Управление структурами и функциями организма - обеспечивается с помощью единого генетического кода из четырех оснований (А- аденин, Т- тимин, Г- гуанин, Ц- цитозин). Код триплетный, поскольку кодон - функциональная единица, кодирующая аминокислоту, состоит из трех оснований (букв).
3.Эволюция организмов - благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.
В узкоспециальном плане ген чаще всего представляет структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи (белка). Хромосома состоит из особых функциональных единиц- оперонов.
Основные этапы развития (усложнения) генетической системы можно представить в виде следующей схемы:
кодон à ген à оперон à геном вирусов и плазмид à хромосома прокариот (нуклеоид) à хромосомы эукариот (ядро).
1.Ядерные структуры бактерий - хроматиновые тельца или нуклеоиды (хромосомная ДНК). У бактерий одна замкнутая кольцевидная хромосома (до 4 тысяч отдельных генов). Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы (репликация ДНК) сопровождается делением клетки. Вегетативная репликация хромосомной (и плазмидной) ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали- от родительской клетки- к дочерней. Передача генетической информации по горизонтали осуществляется различными механизмами - в результате конъюгации, трансдукции, трансформации, сексдукции.
2.Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидами, мигрирующими генетическими элементами - транспозонами и инсервационными (вставочными) или IS- последовательностями.
Плазмиды- экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.
Их выделение в отдельный класс определяется существенными отличиями от вирусов.
1.Среда их обитания - только бактерии (среди вирусов, кроме вирусов бактерий- бактериофагов имеются вирусы растений и животных).
2.Плазмиды сосуществуют с бактериями, наделяя их дополнительными свойствами. У вирусов эти свойства бывают только у умеренных фагов при лизогении бактерий, чаще же всего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток.
3.Геном представлен двунитевой ДНК.
4.Плазмиды представляют из себя"голые" геномы, не имеющие никакой оболочки, их репликация не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.
Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. Учитывая зависимость отналичия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra- оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий- интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды (эписомы).
Генетический материал бактерий. - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Генетический материал бактерий." 2017, 2018.
тема: Генетика бактерий1865 год Мендель установил существование генов. 1869 Фишер выделил ДНК. Через 80 лет доказано что носителем генов является ДНК, 1953 Крик, Уотсон – расшифрована структура ДНК.
Ген выполняет следующие основные функции :
Непрерывность наследования генетической информации благодаря механизму репликации ДНК
Управление структурами и функциями организма с помощью генетического кода
Благодаря мутации и генетическим рекомбинациям, которые происходят в гене осуществляется эволюция всех живых организмов.
Код триплетный → кодон состоит из 3 букв и кодируют одну аминокислоту
Код не перекрывающийся
Число бессмысленных кодонов очень маленькое (3 из 64)
Последовательность расположения кодов в гене определяет последовательность положения аминокислотных остатков в полипептидной цепи
Код универсален
Способность к самоудвоению с помощью механизма саморепликации
Самовыражение (экспрессия) с помощью регулируемого синтеза матричной РНК
Самообновление с помощью мутаций, рекомбинаций и самоподвижных элементов
Самоисправляемая (ревизия, репарация, супрессия)
Гены вирусов и эукариотов состоят из экзона (кодирующий) и интроны (не кодирующие). У вирусов в одном и том же фрагменте могут существовать 2 гена с разными рамками считывания. Ген не всегда строго ограниченный участок хромосомы, есть подвижные участки у бактерий. Ген требует регулирования (регуляторы, промотеры). Ген единственные носитель и хранитель жизни, а белок определяет форму и способ жизни.
Эволюция генетической системы шла в направлении кодон(триплет) → ген → оперон → геном вирусов и плазмид → хромосома прокариотов → хромосома эукариотов (ядро).
Объем генома у представителей различных живых организмов сильно отличается. Можно измерить в следующих единицах: молекулярная масса нуклеиновых кислот либо в количестве нуклеотидных пар либо в количестве генов. Все эти значения сопоставимы ген в среднем включает 1000 пар нуклеотидов (вируса гепатита В – 4 гена; ВИЧ – 9 генов)
Генотип – вся совокупность генов у данного вида организма. 10%-70% не кодирующие гены (повторяющиеся последовательности), они не относятся к генотипу и составляют геном.
Фенотип – внешние проявления генотипа в конкретных условиях внешней среды при изменении внешних условий меняется генотип, но генотип при этом сохраняется.
^ Особенности генетики бактерий.
Хромосомы бактерий располагаются свободно в цитоплазме, не ограничены мембранами, но во всех случаях ДНК бактерии связана с рецепторами на мембране.
Бактерии гаплоидны, содержание ДНК не постоянно, может достигать 2, 4, 6, 8 – хромосом (у других организмов оно постоянно и удваивается только перед делением).
Передача генетической информации идет не только по вертикале (материнская→дочерняя), но и по горизонтали (конъюгация, трансформация)
Помимо хромосомного генома имеется не хромосомный генетический материал, который называется плазмидным геномом (эписомы, внехромосомные факторы наследственности). Это наделяет клетку дополнительными биологическими свойствами.
Содержание ДНК у бактерий зависит от условий их роста или от времени клеточного цикла бактерии, которые осуществляется каждые 20-30 минут, поэтому и количество может соответствовать (4,6,8) и это сопровождается увеличением количества рибосом (этапы транскрипции, трансляции идут одновременно, возможность регулировать скорость размножения главное условие сохранения вида.
^ Особенности репликации.
Вегетативная репликация: обуславливает передачу информации по вертикали, контролируется хромосомными и плазмидными генами.
Конъюгативная репликации: перенос материала по горизонтали и контролируется только плазмидными генами, при этом происходит достройка нити ДНК комплиментарной нити от донора к реципиенту.
Репаративная репликация: механизм при котором устраняется из ДНК поврежденный участок
Стркуктурно-функциональной едициней является оперон – группа структурных генов связанных с особым геном оператором, он управляет всей группой структурных генов и идет как самостоятельная единица, находится под контролем гена модулятора. В хромосоме гены распределяется друг за другом контролируя разные процессы, но законченный результат можно получить выбирая не последовательно (как игра на пианино).
^ Хромосомная карта бактерий
ромосомы бактерий имеют кольцевую форму, гены располагаются линейно, их можно последовательно расположить. Локализация генов определяют в минутах их переноса, и хромосомная карта это 0-100 минут.
Определение локализации гена на хромосоме называется картированием, а их расположение хромосомной картой масштаб которой в минутах. В настоящее время есть карты: кишечной палочки.
^ Изучение организации генома бактерий.
Проводится с помощью ферментов – рестриктаз способные расщепить ДНК в специфических участках, которые они комплиментарны. В настоящее время известно более 100 рестриктаз. С помощью них можно получить рестрикционные фрагменты ДНК → рестрикционный анализ. Сравнение рестрикционных фрагментов и называется рестрикционным анализом, который может быть использован для идентификации. Делают копии цепей ДНК, которые имеют липкие концы с помощью которых фрагменты вновь могут образовывать кольца. Именно за счет липких концов можно получать между разными фрагментами ДНК – рекомбинантные ДНК. Если эти фрагменты получены с помощью одной рестриктазы они могут вступать во взаимодействия между собой.
Метод клонирования. Выделенный фрагмент ДНК с помощью рекомбинантных молекул вводится в самореплицирующую генетическую структуру – в плазмиду, вирус и дальше они выполняют роль вектора для клонирования. Их сшивают с фрагментом ДНК – геномом, который будет размножаться в составе плазмилы или в составе геном бактериальной клетки. Такие гибридные ДНК также можно выделить из клетки за счет рестрикции – вырезания. С помощью клонирования можно получать большое количество копий любого фрагмента ДНК, который можно метить радиоактивной меткой.
Метод сегвинирования. Используют для определения последовательности расположение ДНК в клонируемом фрагменте ДНК. Методы секвинирования и клонирования это методы помогающие изучить геномы в т. ч. геном человека (2004).
^ Плазмидный геном бактериальной клетки.
Плазмиды – фрагменты ДНК с небольшой молекулярной массой, несут от 40 до 50 генов. Они выполняют также регуляторную и структурную функцию. Плазмиды могут располагаться либо в цитоплазме, могут иметь кольцевую структуру. Могут находится в интегрированном состоянии хромосомы (эписомы).
Свойства плазмид:
Не обязательные генетические элементы бактерий (дополнительные).
Обладают саморепликацией и автономностью, независимостью от хромосомы клетки. ДНК бактерии им не управляет.
Склонны к трансмиссии как по вертикали, так и по горизонтали обеспечивая при этом гегетическую изменчивость бактерий.
F-фактор – кольцевая молекула. Ее гены кодируют образование половых ворсинок, размножение бактерий, скорость размножения с ней связывают конъюгацию, участвует в горизонтальной передаче генетического материала и передаются различные свойства: устойчивость к антибиотикам, лактозо положительность.
R-фактор – детерминирует продукцию фермента β-лактамызы → устойчивость к антибиотикам. В составе этой плазмиды может быть специальный tra-оперон (ген отвечающий за перенос) → плазмида легко передается.
Hly – плазмида связана с продукцией гемотоксина → более токсигенные бактерии.
Col-фактор отвечает за продукцию колицинов (антибиотикоподобные вещества) обеспечивающих преимущество бактерий перед другими.
Плазмиды био деградации: участвуют в расщепдлении веществ загрязняющих окружающей среды.
Плазмида умеренного фага - фаг который способен распознать, внедрится, в клетку, но вызвать лизис бактерии вызвать не может. Может покидать клетку, захватывать часть генетического материала клетки и внедряясь в другую клетку участвует в переносе генетического материала (трансдукция)
Плазмиды есть конъюгативные (способные к переносу, имеющие в своем составе ген переноса), неконъюгативные (не участвуют в рекомбинации). По совместимости есть несовместимые друг с другом, совместимые.
^ Транспазоны, IS-последовательности.
Относятся к дополнительным генетичесим элементам
Th-маленькие участки ДНК (прыгающие) - в составе могут быть Rгены. Могут находится как в составе ДНК, так и в составе плазмид. Странспазонами связны мутации бактерии поскольку они могут перемещаться и вызывать мутации типа делеции, инверсии, дупликации.. Транспазоны ограничены с двух сторон IS-последовательностями.
IS-фрагменты – маленькие фрагменты ДНК, повторяющиеся, не способны к репродукции в свободном состоянии не участвуют. Основные функции: регуляторные (способны включить - выключить ген). Координируют взаимодействие транспазонов плазмид, фагов как между собой так и с хромосомой клетки хозяина.
^ Изменчивость бактерий.
Модификационная: адаптивная реакция организмов в ответ на условия внешней среды. Могут изменять морфологические, культуральные, ферментативные свойства.
Генотипическая: затрагивает генотип клетки:
Мутационная – изменение первичной структуры ДНК, могут быть связаны с выпадением нуклеатида, делецией могут носить характер инверсии. Могут быть хромосомные, плазмидные. Могут быть спонтанные, индуцированные. Значение эволционные изменение, сопроваждается селекцией.
Комбинативная: трансформация – передача генетического материала в виде раствора ДНК донора к реципиенту, трансдукция – перенос генетического материала от донора к реципиенту с помощью умеренных фагов (неспецифическая, специфическая), конъюгация – передача генетического материала от донора имеющего F-фактор к реципиенту через половые ворсинки с образованием новых штаммов.
Особенности генетики вирусов .
Молекулярная масса геном вирусов 10 6 меньше чем масса эукариотической клетки.
Организация генетического аппарата такая же
Генов от нескольких единиц до десятков.
Принцип 1 ген – молекул РНК – 1 белок у вирусных ДНК нарушен и иРНК вирусов может направлять синтез 2 и более белков.
Двукратное считывание одной и той же и РНК, но с другого кодона.
Сдвиг рамки трансляции
Сплайсинг (вырез интронов)
Транскрипция с перекрывающихся областей нуклеиновой кислоты → размывается границы гена и понятие ген приобретает функциональное значение.
Модификационная . В основном для вирусов определяет клетка хозяина. Модификация затрагивает суперкапсид.
Генотипическая . Мутационная, то есть изменение в первичной структуре нуклеотидов.
Рекомбинативная . Происходит при одновременном заражении клетки хозяина двумя или более вирусами, происходит обмен генами → образуются рекомбинантные штаммы вирусов, которые содержат гены 2 и более штаммов.
^ Генетическая реактивация . Процесс при котором вирионы дополняют друг друга в следствии перераспределения генов во время их репликации. Это наблюдается у вирусов с фрагментарным геномом. При скрещивании таких вирусов происходит образование полноценных единиц.
Комплементация (дополнение). Не генетически й процесс при котором вирус снабжает своего партнера (как правило дефектного) недостающими компонентами белка, а не нуклеиновыми кислотами. Характерна для многих вирусов – аденовирусы могут культивироваться только в присутсвии SV 40 – вирус. Вирус гепатита В является помощником для δ - вируса (HDV).
^ Фенотипическое смешивание . Наблюдается при совместном культивировании двух вирусов наблюдаем, что геном одного вируса заключается в капсид другого вируса. Генотип при этом не меняется
^ Генная инженерия.
Биотехнология использование биологических объектов (клеток микроорганизмов, грибов, животных, людей) для получения полезных для человека продуктов, которые не могут быть получены другим путем. Основное направление это генная инженерия. Появилась с 1972 когда появилась первая работа по генной инженерии.
Объект генной инженерии: ген или группа генов.
Источники получения: вирусы, прокарилты
Цель: пересадка гена в другие, гетерогенные системы, экспрессия этого гена и т.о. получать полезные продукты (белки, фермены, гормоны, лекарственные препараты и другие БАВ)
Инструмент генной инженерии: ферменты рестриктазы с помощью которых можно получать фрагменты генома. Рестриктазы имеют липкие концы для сшивания различных генов. Если их нет используют лигазы .
Этапы генной инженерии:
выделение гена из клетки с помощью рестриктаз из генома клетки.
присоединение гена к вектору (переносчику) – плазмиду, ДНК, РНК втрусов, умеренные фаги, искусственные плазмиды. Основные требования к вектору – должен выполнять роль саморепликации. Этот этап сопроваждается образованием рекомбинантной ДНК (ген+вектор)
введение рекомбинантной ДНК в гетерогенную систему. В качестве этой системы выступает клетка прокариотов, эукариотов, соматическая.
экспрессия введенного гена, создаются условия что бы рекомбинантная молекула начала самореплицироваться и заставила клетку продуцировать вещество, которое кодирует перенесенный ген.
клонирование гена и выделение продукта, очитка продукта и выхода продукта
Бактерии – прокариотические микроорганизмы, генетический материал которых в основном представлен единственной кольцевой двухцепочечной ДНК, называемой генетиками хромосомой. В относительно редких случаях хромосома представлена линейной молекулой ДНК.
Размер этой ДНК намного превышает размер самой бактериальной клетки. Так, например, у E. coli протяженность хромосомной ДНК равна 1300 мкм (1,3 мм – 4,6 х 10 6 п.н.), а размер клетки 1,1-1,5 х 2,0-6,0 мкм. Причем ДНК не заполняет всю клетку, а содержится только в ограниченной области, составляющей, весьма приблизительно, одну треть объема клетки.
Рис.1. Бактериальный геном и схема уровней его компактизации.
Отсюда следует, что ДНК существует в клетке в высокоупорядоченном (сконденсированном) состоянии в виде компактной структуры. Эта структура, отдаленно напоминая ядра эукариот, получила название нуклеоид и видна в микроскопе только после специфичных для ДНК окрасок (рис.1). В электронном микроскопе она выглядит как образование, состоящее из многочисленных петель, отходящих от плотной центральной области. Образование большого числа (до 140 на геном) петель, называемых доменами , является одним из уровней компактизации ДНК. Каждый домен закреплен у основания молекулой РНК и состоит примерно из 40 т.п.н. ДНК петель находится не в виде свободно вытянутого дуплекса, а имеет второй уровень компактизации за счет скручивания в сверхспиральные образования с помощью связи с белками HLP.
Эти белки имеют небольшой размер, обладают сильноосновными свойствами и прочно связываются с ДНК. По аминокислотному составу они напоминают гистоны эукариот.
Нуклеоид не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной и прикреплен к мезосомам – специфическим впячиваниям цитоплазматической мембраны внутрь клетки. Связь ДНК со специфическим участком мембраны необходима для функционирования генома.
Кольцевая молекула ДНК бактерий (хромосома) представляет самореплицирующуюся генетическую молекулу – репликон . Репликация начинается с точки инициации репликации (ori – orign) , локализующейся, как правило, в участке прикрепления ДНК к мембране. От точки инициации репликация происходит последовательно, двунаправленно, по полуконсервативному механизму. Заканчивается репликация в районе терминации репликации (ter) , расположенном на участке кольцевой ДНК, противоположном точке начала репликации (рис.2).
Рис. 3. Распределение дочерних копий ДНК и деление клетки бактерий.
Число хромосом в одной клетке бактерий зависит от стадии развития и физиологических условий роста культуры. В логарифмической стадии роста у E. coli на 1 нуклеоид приходится 2,8 ДНК эквивалентов одного генома, вследствие замедленной сегрегации двух дочерних хромосом, или реинициации новых циклов репликации ДНК еще до деления клетки (рис.4).
Рис.4. Число хромосом в клетке в стационарной (А) и логарифмической (Б) стадиях роста культуры.
У некоторых бактерий клетки в норме содержат не одну, а много хромосом. Они могут формировать один или несколько нуклеоидов. Также наблюдается зависимость содержания ДНК в клетке от ее размеров, хотя это не означает соответствующего изменения объема генетической информации.
Для бактериальной ДНК характерна высокая плотность генов (1 ген на 1тпн). ДНК, кодирующая белки, составляет около 85-90% всей ДНК. Средний размер ДНК-последовательностей между генами – только 110-125 п.н. Некодирующая бактериальная ДНК занимает менее 1%, и она обычно представлена в виде транспозонов. Так, в ДНК штамма Escherichia coli K12 линии MG 1655 найдена 41 копия различных транспозонов (IS), которые участвуют в процессах внедрения и исключения плазмид. Многие фаги, исключаясь из генома бактерии не полностью, оставляют там в качестве следа некоторые свои гены. Эти остатки, не способные к самостоятельному перемещению и развитию, называют "криптическими" фагами.
Интроны встречаются в бактериальных геномах крайне редко. Имеются случаи перекрывания генов, где один ген находится внутри другого на той же нити ДНК. Для бактериальных геномов характерны опероны: у Е. coli 27% предсказанных транскрипционных единиц являются оперонами.
В клетке бактерий могут содержаться и другие репликоны, способные существовать отдельно от бактериальной хромосомы. Их называют плазмидами . Плазмиды представляют собой кольцевые (у некоторых видов линейные) молекулы двухцепочечной ДНК различных размеров от 1000 п.н. до почти трети величины самой бактериальной хромосомы. Количество и спектр плазмид в клетках бактерий может варьировать. Часто наблюдаются различия по спектру плазмид даже между клетками разных штаммов одного и того же вида бактерий. Некоторые плазмиды могут встраиваться в бактериальную хромосому, составляя при этом часть репликона бактерии, и могут вновь исключаться из нее, восстанавливая форму автономного репликона. Такие плазмиды называют эписомами .
В генетический материал бактерий могут быть включены и профаги.
Современная биология и генетика обязаны своими выдающимися достижениями микробиологии, которая предоставила им микроорганизмы в качестве экспериментальных объектов. Важность и актуальность исследований в области генетики микроорганизмов заключается прежде всего в том, что они впервые создали методы управления наследственностью.
В 1865 году чешский ученый Грегор Мендель открыл существование генов как дискретных единиц наследственности. В 1928 году Ф. Гриффитс впервые осуществил трансформацию невирулентных пневмококков в вирулентные. Он заразил белых мышей смесью бактерий, состоящей из убитых нагреванием, следовательно, потерявших вирулентность капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентных пневмококков. В контрольных опытах эти группы бактерий, введенные порознь, мышей не убивали. Однако в опытной группе мыши погибли и из крови их были выделены живые пневмококки, приобретшие капсулу убитых пневмококков. Следовательно, убитые капсульные пневмококки содержали вещество, способное передать признак капсулообразования (вирулентности) живым пневмококкам. Механизм трансформации оставался неизвестным.
В 1953 году Ф. Крик и Д. Уотсон определили структуру гена, основанную на двойной спирали ДНК. Это открытие показало, каким образом ген выполняет свои три важнейшие функции:
- 1) непрерывность наследственности - полуконсервативным механизмом репликации ДНК;
- 2) управление структурами и функциями организма - с помощью генетического кода, использующего запас всего из четырех оснований (букв) - аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц);
- 3) эволюцию организмов благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.
Работами Ф. Крика, С. Бреннера, М. Ниренберга, С. Очоа, X. Кораны с использованием микробных объектов к 1966 г. генетический код был расшифрован, показана его триплетность, неперекрываемость и универсальность для всех живых организмов.
Ученые оценили удобство работы с бактериями и вирусами, обусловленное их свойствами: коротким периодом генерации, быстрым накоплением популяций с огромным количеством особей, простотой культивирования и использования. На бактериальных объектах были открыты информационные, рибосомальные, транспортные РНК и установлен механизм синтеза белка. Д. Ледерберг и Э. Татум открыли у бактерий конъюгацию, В. Хейс - плазмиду, определяющую половую полярность бактерий. Ф. Жакобом и Э. Вольманом создано учение о плазмидах. Разработанная на модели кишечной палочки Ф. Жакобом и Ж. Моно концепция оперона стала универсальной концепцией генетического контроля экспрессии генов.
В 1972 году возникла и бурно развивается генная инженерия. Ключевое значение для ее возникновения и управления наследственностью имело обнаружение в 1970 г. Г. Теминым, С. Мизутани, Д. Балтимором у некоторых онкогенных вирусов фермента - обратной транскриптазы (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза). Это позволило получать на матрице информационной РНК копийный ДНК-ген и использовать его в генной инженерии. В биотехнологии, основанной на генной инженерии, широко используются бактериальные ферменты, плазмидные и вирусные векторы, а также бактерии как основные продуценты биологических продуктов.
Прокариоты (бактерии) имеют морфологически обособленные клеточные структуры, содержащие генетическую информацию, - ну- клеоиды. Нуклеоид состоит из одной свернутой в клубок хромосомы, которая свободно располагается в цитоплазме, но связана с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поэтому бактериальная клетка в отличие от эукариот гаплоидна, т.е. содержит один набор генов.
В некоторых условиях клетки бактерий могут содержать совершенно идентичные по набору генов копии хромосомы, и бактерии остаются гаплоидными. В отличие от всех других организмов бактерии обладают уникальным свойством изменять массу своей ДНК, регулируя в зависимости от условий обитания содержание копий своих генов, эквивалентно массе 2, 4, 6, 8 хромосом. Это позволяет им регулировать скорость собственного размножения - одно из главных условий, обеспечивающих выживание бактерий в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.
Бактериальная хромосома представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК (кольцевую хромосому), содержащую гены, расположенные в линейном порядке. Поскольку длина хромосомы (у Е. coli около 1000 мкм) во много раз превышает длину бактерии (1,5-3,0 мкм в среднем), хромосома компактно упакована в суперспирализованной форме в виде 12-80 петель, связанных с сердцевинной структурой, представленной особым классом РНК - 4,5 S РНК. Геном (вся совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме у данного индивидуума) и генотип (вся совокупность индивидуальных генов у данного индивидуума) у бактерий не однозначны, но близки, так как большинство генов содержатся в хромосоме в единственном числе, в отличие от эукариот, содержащих до 30-50% повторяющихся последовательностей нуклеотидов в геноме. Поэтому размеры геномов у бактерий, вирусов, плазмид выражают либо в молекулярной массе, либо количеством нуклеотидных пар геномной нуклеиновой кислоты, либо количеством генов. Эти значения сопоставимы, так как в среднем каждый ген состоит из 1000 пар нуклеотидов, а масса одного нуклеотида ДНК - 500 дальтон. Так, хромосома Е. coli имеет молекулярную массу 2,8 х ю 9 дальтон, количество нуклеотидных пар 3,8 х Ю 6 и содержит 2500-3000 генов.
Хромосома бактерии состоит из двух типов генов: структурных (цистронов), кодирующих синтез определенной полипептидной цепи, и регуляторных (или акцепторных), регулирующих активность генов (регуляторы, операторы, промоторы, аттенуаторы, терминаторы идр.). Основной структурно-функциональной единицей хромосомы является оперон. Это группа структурных генов-цистронов, физически сцепленных друг с другом и с геном-оператором, который управляет их выражением. В свою очередь оперон или их группа находится под управлением одного гена-регулятора, что представляет более сложную структурно-функциональную единицу - регулон.
Гены в хромосоме располагаются линейно, поэтому можно изучать их последовательность и составлять хромосомную (генетическую) карту. Для этого изучают время переноса соответствующих генов при конъюгации бактерий. Локализацию генов на хромосоме определяют в минутах их переноса, в частности у кишечной палочки - от 0 до 100 мин.
В настоящее время основным методом изучения организации геномов живых организмов является секвенирование - определение последовательности расположения нуклеотидов в составе ДНК генов. Предварительно с помощью методики клонирования получают большое количество необходимых фрагментов ДНК. Уже полностью изучена нуклеотидная последовательность ДНК хромосом 20 важнейших бактерий (К pest is, Е. coli, Р. aeruginosa и др.).
Некоторые гены и группы генов хромосомы бактерий и плазмид бактерий относятся к транспонируемым генетическим элементам, т.е. генетическим структурам, способным в интактной форме перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому, например, от плазмидного к бактериальному и наоборот. Транспонируемые генетические элементы представлены IS-элементами и транспозонами. IS-элементы, или вставочные последовательности (от англ, insertion sequence), имеют обычно небольшие размеры, не превышающие двух тысяч пар оснований. Они несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают: IS 1, IS2, IS3 и т.д. Транспозоны (Тп) представляют собой более крупные сегменты ДНК, фланкированные инвертированными IS-элементами. Помимо генов, обеспечивающих их транспозицию, они содержат другие различные гены. Внутри крупного транспозона могут находиться более мелкие транспозоны.
Транспозоны способны встраиваться в различные участки хромосомы или переходить от одного генома в другой. Очень часто транспозоны содержатся в составе R-плазмид. Транспозоны обнаружены в составе геномов бактерий, плазмид, вирусов, эукариот. Им принадлежит важная роль в изменчивости и эволюции живой материи. Обозначают транспозоны порядковым номером: Тп1, Тп2, ТпЗ и т.д.
Все известные плазмиды представляют собой небольшие, ковалентно-замкнутые в кольцо суперспирализованные молекулы двунитевой ДНК, размеры которых варьируют от 1,5 до 200 МД (от 1500 до 400 000 пар нуклеотидов). Чем больше молекулярная масса, тем сложнее набор генов и многообразнее функции плазмид. Плазмиды содержат гены саморепликации; гены, контролирующие самоперенос или мобилизацию на перенос; другие гены, определяющие специфические функции самой плазмиды. Например, F-плазмиды определяют донорские функции клетки и способность ее к конъюгации; Ent-плазмиды - синтез энтеротоксинов; биодеградативные плазмиды - разрушение различных органических и неорганических соединений.
Для плазмид характерны следующие свойства:
- саморегулируемая репликация;
- явление поверхностного исключения (механизм, который не позволяет проникнуть в клетку, уже содержащую плазмиду, другой, родственной ей, плазмиде);
- явление несовместимости (две близкородственные плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке, одна из них подвергается удалению);
- контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки (различают малокопийные - 1-4 копии и многокопийные - от 12 до 38 копий плазмиды);
- контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине;
- контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки;
- способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид);
- способность к мобилизации на перенос (у неконъюгативных плазмид);
- способность наделять клетку-хозяина дополнительными важными биологическими свойствами, способствующими выживанию бактерий и плазмид в природе.
Плазмиды распространяются среди бактерий двумя способами: по вертикали - путем передачи от родительской клетки дочерним клеткам в процессе клеточного деления бактерий; по горизонтали - путем переноса между клетками в популяции бактерий независимо от клеточного деления. Перенос плазмид между бактериальными клетками осуществляется по механизму самопереноса путем конъюгации, контролируемой tra-опероном плазмиды. В зависимости от наличия этого оперона плазмиды подразделяют на конъюгативные и неконъю- гативные. Возможны также другие механизмы переноса плазмид (мобилизации на перенос неконъюгативных плазмид с помощью конъю- гативных плазмид, трансформации, трансдукции).
Классификация плазмид основана на их уникальном свойстве несовместимости, т.е. неспособности родственных плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке. Она проявляется после проникновения плазмиды в клетку, уже содержащую близкородственную ей плазмиду. Плазмиды, не совместимые друг с другом, но совместимые с другими, объединяются в одну Inc-группу. Например, у энтеробактерий обнаружены 39 Inc-групп плазмид. Плазмиды, относящиеся к одной Inc-группе, обладают многими общими признаками.
Плазмиды имеют важное медицинское значение, так как контролируют синтез различных факторов патогенности бактерий и их лекарственной резистентности. Общебиологическое значение плазмид состоит в том, что они являются уникальным средством самозащиты бактерий и благоприятствуют сохранению бактерий в природе.
Передача генетической информации потомству (вегетативная репликация ДНК) осуществляется у бактерий и плазмид по универсальному механизму - полуконсервативной репликацией ДНК. При этом дочерние клетки получают ДНК хромосомы, у которой одна нить родительская (консервативная), другая нить ДНК вновь синтезирована на ее матрице, что обеспечивает очень точную передачу генетической информации (наследственность). Вегетативная репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы (oriC), который распознается ферментами, инициирующими репликацию. Она носит полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях, заканчивается в строго фиксированной точке - terminus. Поскольку цепи ДНК антипараллельны (если одна нить начинается с 5-го конца, другая - с 3-го конца), а ДНК-полимераза Ш осуществляет синтез ДНК только в направлении 5-3, репликация происходит различно на каждой нити: на одной из расплетенных нитей («прямой», «лидерной») она идет непрерывно, а на другой («отстающей») ДНК-полимераза Ш должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5-3, прерывисто, через образование сегментов Оказаки длиной у бактерий около 1000 нуклеотидов.
Скорость репликации ДНК у Е. coli при 37 °С соответствует включению 2 х ю 3 пар нуклеотидов в 1 сек. В репликации ДНК участвует комплекс ферментов, образующих единую структуру - реплисому. Генетический контроль репликации ДНК осуществляет большая группа генов хромосомы.
Помимо вегетативного типа у бактерий имеются конъюгативный и репаративный типы репликации ДНК. Конъюгативная репликация происходит при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется плазмидными генами (tra-оперон). При этом осуществляется достройка второй нити ДНК, комплементарной нити, передаваемой от донора реципиенту. Репаративная репликация служит механизмом устранения из ДНК структурных повреждений или происходит на заключительном этапе генетической рекомбинации. Она контролируется хромосомными и плазмидными генами.
Информация, содержащаяся в геноме бактерий, расшифровывается, материализуется и реализуется путем биосинтеза белка. Универсальности генетического кода соответствует универсальность его расшифровки и реализации (экспрессии). Однако биосинтез белка у бактерий имеет некоторые особенности на этапе транскрипции. Гены бактерий в отличие от генов эукариот и вирусов не содержат нитронов, поэтому у бактерий отсутствует процесс сплайсинга при синтезе мРНК. Сплайсинг РНК - процесс, при котором происходит вырезание интронов (некодирующих последовательностей у генов, имеющих интрон-экзонную структуру) из первичных РНК-транскриптов и сшивание экзонов, в результате которого образуется и затем транслируется зрелая мРНК. Отсутствие сплайсинга РНК у бактерий является естественным генетическим барьером в реализации генетической информации эукариот у бактерий (прокариот). Преодоление этого барьера привело к созданию генной инженерии на бактериальных объектах.
Генетическая информация реализуется микроорганизмами весьма «экономно», в соответствии с конкретными условиями их существования. «Работают» (экспрессируются) только гены, необходимые для обеспечения жизнеспособности клетки в данных условиях. Саморегуляция системы генетической информации обеспечивается наличием в ней помимо структурных генов, кодирующих белки и другие макромолекулы, особых последовательностей нуклеотидов (акцепторных или регуляторных генов), не имеющих кодирующих функций, но управляющих работой структурных генов. Как уже упоминалось, совокупность расположенных рядом структурных и регуляторных генов составляет оперон-единицу генетической регуляции. Классической моделью оперона является лактозный оперон. Рассмотрим на примере лактозного оперона кишечной палочки его устройство и способ регуляции активности структурных генов, кодирующих синтез ферментов, участвующих в усвоении лактозы.
Начинается оперон с «участка прикрепления белка-активатора» - продукта вышестоящего регулона (Сар-белка, без которого РНК-полимераза не может связаться с опероном и начать транскрипцию). Далее на хромосоме расположен промотор - участок распознавания РНК-полимеразой и прикрепления ее. Затем следует оператор - участок, с которым связывается особый тормозящий транскрипцию белок-регулятор. После оператора расположены последовательно структурные гены z, у, а, кодирующие соответственно синтез трех ферментов, участвующих в усвоении лактозы, - Я-галактозидазы, галактозидпермеазы, тиогалактозидтрансацетилазы. Заканчивается lac-оперон терминатором - небольшим участком ДНК, служащим стоп-сигналом, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипцию оперона. Вне 1ас-оперона, на другом месте хромосомы находится особый ген-регулятор, кодирующий непрерывный синтез белка-регулятора. Когда в окружающей среде нет лактозы, белок- регулятор прикрепляется к оперону и как «шлагбаум» препятствует продвижению РНК-полимеразы от промотора к структурным генам, репрессируя транскрипцию и в итоге синтез ферментов. Лактоза, если она есть в питательной среде, связывается с белком-регулятором, ал- лостерически изменяет его конфигурацию, в результате чего белок-регулятор уже не может прикрепляться к оператору. В итоге «шлагбаум» открыт, РНК-полимераза транскрибирует структурные гены в соответствующие мРНК, на матрице которых синтезируются ферменты, усваивающие лактозу.
Таким образом, лактоза индуцирует синтез ферментов, нужных для ее усвоения. Такие ферменты называются адаптивными или индуктивными. Рассмотренный тип регуляции активности генов называется негативным, так как в основе его лежит репрессия оперона белком-регулятором. Есть два варианта этого типа регуляции: негативная индукция, которую мы рассмотрели, и негативная репрессия.
В последнем случае в исходном положении белок-регулятор не может связываться с оператором, и синтез ферментов идет, а при наличии эффектора, обычно конечного продукта действия анаболических ферментов, белок-регулятор под его воздействием связывается с оператором и синтез ферментов репрессируется. Кроме негативного известен еще позитивный тип генетической регуляции синтеза белка. Отличие его от негативного типа заключается в том, что белковый продукт гена-регулятора не запрещает транскрипцию оперона, а наоборот, активирует ее. Этот тип регуляции также встречается у бактерий в двух вариантах - позитивной индукции и позитивной репрессии. Например, ara-оперон, контролирующий усвоение арабинозы, работает у кишечной палочки по механизму позитивной индукции.
Проявление признаков живых организмов, контролируемых генотипом, зависит от условий существования организма. Совокупность признаков организма в конкретных условиях его существования называется фенотипом. В зависимости от условий микроорганизмы одного генотипа могут иметь различные фенотипы, так как реализуется различная часть генетической информации генотипа или реализация происходит в различном диапазоне нормы реакции генотипа. Смена фенотипов при смене условий существования организма называется модификацией. Иными словами, модификации - это фенотипические различия, вызываемые внешними факторами у одинаковых в наследственном отношении микроорганизмов.
Отличительными признаками модификации у бактерий являются (три «О»):
- определенность изменчивости (определенный фактор внешней среды, условий вызывает изменение строго определенного признака);
- общность изменений (изменения признака одновременно у всех или большинства особей генетически однородной популяции);
- обратимость изменений (изменения не наследуются, после прекращения действия внешнего фактора исчезают).
В некоторых случаях у бактерий наблюдаются так называемые длительные модификации, когда изменение признака сохраняется в нескольких поколениях после прекращения действия фактора. Это обусловлено тем, что при делении клеток передаются не только структуры генотипа, но и содержимое клетки, частично сохранившее остатки веществ, образовавшихся в предыдущих условиях.
Рассмотрим пример модификационной изменчивости бактерий. При посеве разведенной культуры бактерий Proteus vulgaris на питательный агар через сутки выросли колонии бактерий, каждая из которых окружена зоной роения. После пересева колоний на питательный агар с желчью все колонии выросли через сутки без роения. После пересева этих колоний на исходный питательный агар все выросшие колонии вновь имели зоны роения.
Изменения фенотипа протея на среде с желчью следует считать модификацией, так как присутствует все три отличительных признака: определенность изменчивости (связь отсутствия роения с фактором - желчью), общность изменчивости (изменения у всех колоний популяции), обратимость (при отсутствии желчи в питательной среде возврат бактерий к исходному фенотипу).
Возможность модификационной изменчивости бактерий следует постоянно учитывать в практической работе микробиологов. Для точной систематики и идентификации бактерий следует строго соблюдать стандартные (унифицированные) условия изучения свойств бактерий (стандартные питательные среды, тесты, реактивы, температуру и другие условия культивирования).
Первоисточником новых генов в природе являются мутации. Общепринятого определения мутации нет. Мутация от лат. mutatio - изменение генетических структур, имеющихся в клетке в данный момент, которое стабильно наследуется. Различают две группы мутаций: хромосомные аберрации, включающие 3 типа (изменение числа наборов хромосом, изменение числа отдельных хромосом, перестройки хромосом) и генные мутации. У бактерии могут быть мутации типа перестройки хромосом и генные мутации. При этом перестройки хромосом осуществляются путем делений (выпадения фрагмента хромосомы), инверсии (поворота участка хромосомы на 180°), транспозиций (вставок в какое-либо место хромосом небольших фрагментов ДНК, например, инсерционных сегментов или транспозонов). Генные мутации бывают односайтовые (в одном участке гена) или многосайтовые. Для появления мутации в гене достаточно точечного изменения одной пары нуклеотидов. По направлению мутации могут быть прямые или обратные. Прямые мутации вызывают изменения признаков организма дикого типа; обратные мутации сопровождаются реверсией к дикому типу. Восстановление исходного фенотипа в результате обратной мутации в ином участке гена или в другом гене является супрессорной мутацией. Мутация, в результате которой изменяются два и более признаков организма, называется плейотропной. Различают также спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно в том смысле, что они детерминированы, но мы не знаем конкретно их причин. Индуцированные мутации вызываются воздействием определенных мутагенных факторов. К ним относятся различные виды ионизирующих излучений, ультрафиолетовые лучи, химические мутагены.
Изменчивость по механизму мутаций характеризуют определенные отличительные признаки.
- 1. Наследственность.
- 2. Низкая частота (скорость) мутирования (у бактерий 1 х Ю 6 - 1 х Ю 7 , т.е. мутация у одной клетки из 1-10 млн). Способность давать мутации (мутабельность) подвержена влиянию генотипа. У бактерий мутабельность резко повышается, если они имеют особые гены - му- таторы. Например, у кишечной палочки обнаружены два гена-мутато- ра - mut Т, mut SI.
- 3. Ненаправленность изменчивости (т.е. неопределенность, неадекватность изменения признаков ввиду воздействующего фактора; один и тот же фактор вызывает различные мутации).
Экспериментами С. Лурия и М. Дельбрюка (флюктуационный тест), Ньюкомба (тест перераспределения) показано существование в исходных популяциях бактерий спонтанных мутантов, устойчивых к воздействующему фактору - фагу - еще до его воздействия. Методика отпечатков (реплик), разработанная Д. Ледербергом, позволила непосредственно выделять из популяции клеток мутанты до воздействия адекватного фактора или после воздействия мутагена - самые различные не адекватные по признакам.
Бактерии имеют особые системы репарации мутационных повреждений ДНК. Наиболее изучены системы: «фотореактивация», «темно- вая репарация», «репликативная репарация». «Фотореактивация» восстанавливает дефекты (тиминовые димеры) в ДНК, вызванные только ультрафиолетовыми лучами. При «темновой репарации» действует комплекс ферментов, восстанавливающий повреждение на одной нити ДНК путем вырезания поврежденного участка и синтеза на его месте второй нити комплементарного отрезка ДНК, замещающего дефект. Система «репликативной репарации» заменяет повреждения обеих нитей ДНК путем рекомбинации.
Другим механизмом наследственной изменчивости является обмен генетическим материалом между клетками популяций бактерий (по горизонтали). Он не создает новых элементарных признаков, но очень ускоряет создание организмов с новыми комбинациями признаков за счет перераспределения генов из разных геномов, что способствует быстрому приспособлению бактерий к условиям среды. Бактерии способны к широкому генетическому обмену между различными видами и родами, а также с бактериофагами и плазмидами. У бактерий выявлены три основные формы обмена генетическим материалом: трансформация, трансдукция, конъюгация (рис. 3.2, 3.3). Они различаются способом передачи генетического материала.
Трансформация характеризуется передачей клетке-реципиенту некоторых генов донора с помощью свободной ДНК, выделенной из генома донора. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Спонтанная трансформация в естественных условиях проявляется в появлении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду при их лизисе или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами. Индуцированная (искусственная) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из бакте- рий-доноров. Для успешной трансформации необходим ряд условий, относящихся к ДНК и бактериям-реципиентам. ДНК должна быть двухцепочечной, иметь фрагменты 3-5 х Ю 6 дальтон, быть частично или полностью гомологичной ДНК реципиента. Клетки реципиента должны обладать компетентностью, т.е. восприимчивостью, что имеет место только в определенный период жизненного цикла, обусловлено выделением клеткой особого белка «фактора компетентности» и специфическим изменением проницаемости клеточной стенки и мембраны. Процесс трансформации состоит из нескольких этапов: связывания ДНК на поверхности компетентного реципиента с «фактором компетентности», проникновения ДНК путем «втаскивания» в клетку, включения ДНК в хромосому бактерии-реципиента путем рекомбинации, экспрессии переданных генов. Эффективность генетической трансформации во много раз повышается, если смесь ДНК и трансформируемых клеток подвергнуть обработке электрическим импульсом (метод электротрансформации). В естественных условиях эффективность трансформации менее существенна, чем других форм передачи генетического материала. Клетки бактерий имеют механизм защиты генома от чужеродной ДНК - особые системы модификации и рестрикции. Эти системы защищают свою ДНК путем модификации (чаще путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК с помощью особых ферментов - рестрикционных эндонуклеаз. Частным вариантом трансформации является трансфекция, когда в клетку-реципиент, лишенную клеточной стенки, вносят ДНК бактериофага или плазмид.
Трансдукция - перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают общую (неспецифическую) и специфическую трансдукцию. Механизм общей трансдукции состоит в том, что в процессе внутриклеточного размножения вирулентного фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равной подлине фаговой. Так возникают дефектные фаги, у которых вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии-донора. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, но при этом размножения фага не происходит. В случае генетической рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки- реципиента новый признак наследственно закрепляется. Таким образом, при общей трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала.
Специфическую трансдукцию отличает перенос строго определенного фрагмента ДНК бактерии-донора умеренными бактериофагами. Как известно, умеренными называют такие бактериофаги, которые могут интегрировать в хромосому клетки бактерий, вызывая ее лизогенизацию. Интегрированный в хромосому бактерии-донора умеренный фаг (профаг) в определенных условиях выходит из хромосомы, «прихватывая» ближайшие участки ДНК хромосомы бактерии и оставляя часть своего генома. Возникает дефектный умеренный фаг, включивший в свой геном бактериальные гены бактерии-донора. Далее трансдуцируюший фаг вносит свою ДНК в клетку бактерии-реципиента, где она вместе с фрагментом ДНК бактерии-донора интегрируется в состав хромосомы реципиента. В последующем фаг может выйти из хромосомы реципиента, но переданные им гены бактерии- донора остаются у реципиента. Примером может служить умеренный бактериофаг лямбда (X), который всегда переносит оперон gal или oneрон bio. Специфическая и общая трансдукция низкочастотны (10 -4 - 10 -7 на 1 частицу фага). Частным вариантом специфической трансдук- ции является фаговая или лизогенная конверсия. Трансдуцирующий фаг, интегрируясь в хромосому реципиента, вызывает лизогенизацию бактерии и передает гены новых признаков, например, токсинообра- зования, дифтерийным бактериям. Однако гены, контролирующие новый признак, постоянно включены в геном таких трансдуциру- ющих фагов. Появление этих генов не связано с предварительным размножением фага на токсигенных донорах. Вероятно, фаг включил в геном эти гены на более ранних этапах своей эволюции. Такие трансдуцирующие фаги недефектны и вызывают фаговую конверсию с очень высокой частотой.
Конъюгация характеризуется переносом генетического материала путем непосредственного контакта между клетками. Этот процесс по- лярен - генетический материал передается только от бактерий-доно- ров к бактериям-реципиентам. Донорская функция клетки и процесс конъюгации контролируются генами конъюгационного переноса (tra- оперон), локализованными в конъюгативных плазмидах. Среди многих конъюгативных плазмид имеется плазмида F, контролирующая только указанные функции. В автономном, внехромосомном состоянии она обеспечивает донорский тип клетки F+ (мужская), образование полых ворсинок (F-пили) и свой собственный перенос в F- (женские) клетки реципиента. При этом хромосома донора не передается, а реципиенты, получившие плазмиду F, приобретают донорский тип F+. При интеграции плазмиды F в хромосому бактерии-хозяина образуются Hfr (high frequency of recombination) - штаммы бактерий с высокой частотой передачи хромосомных генов. Однако плазмида F обычно не переходит в клетку реципиента, так как находится на конце хромосомы, противоположном тому, с которого начинается ее переход.
Переход хромосомы через конъюгационный мостик между клетками через канал F-пили сопряжен с ее репликацией. При этом через мостик проходит только одна нить ДНК хромосомы, на которой в клетке реципиента синтезируется комплементарная вторая нить, и далее под контролем генов рекомбинации (гес А) хромосомы реципиента происходит интеграция переданного фрагмента ДНК в хромосому реципиента. Плазмида F может ревертировать у Hfr-штаммов в исходное внехромосомное состояние, захватив прилегающий участок бактериальной хромосомы. Таким способом формируется плазмида F’ (F-прим), несущая часть хромосомных генов бактерии-хозяина, например, плазмида F’ lac. Перенос генов донора в клетки реципиентов посредством плазмид F’ называется сексдукцией. При этом плазмида F’ переносит свой геном, содержащий и некоторые гены донора, с высокой частотой, а хромосома бактерии-донора не передается.
Перенос других видов конъюгативных плазмид (R, Ent, Col и др.) также происходит с высокой частотой. Следует отметить, что эффективный перенос плазмид путем конъюгации не знает «родственных» барьеров и происходит между бактериями различных видов и родов.
При любой форме обмена генетическим материалом заключительным этапом является рекомбинация между полученной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. При переносе одной нити ДНК вначале происходит достраивание комплементарной ей нитью. Рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Известны общая рекомбинация, сайт-специфическая рекомбинация и рекомбинация, контролируемая транспонируемыми элементами.
Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация обусловлена наличием специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК, например, хромосомы Е. coli и умеренного бактериофага лямбда. Общая и сайт-специфическая рекомбинации контролируются геном гее А. Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, также сайт-специфичны и определяются особыми нуклеотидными последовательностями, однако не зависят от гее А гена. Ведущая роль в процессах рекомбинации у бактерий принадлежит гену гее А. Его продукт - белок Rec А (молекулярная масса 38 кД) обладает уникальными функциями: прочно связывается с одиночными нитями ДНК; способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; удерживает вместе одиночную нить ДНК и двойную спираль ДНК; обладает свойством ДНК-зависимой АТФ-азы. Ген гес А участвует не только в процессе рекомбинации. Его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и других важных функций бактерий. Рецессивные мутации в таком гене отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность представляет единую SOS-систему. Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта гена гес А. SOS-система срабатывает после любых повреждающих воздействий на ДНК. Поэтому ген гес А имеет основное значение в самозащите генетической системы бактерий.
Применение методов генетики для изучения генома бактерий позволило создать геносистематику бактерий. На ее основе существенно уточнена действующая классификация бактерий и созданы предпосылки разработки естественной систематики и классификации. В интересах систематики используют ряд методов. Метод гибридизации ДНК-ДНК (выявления уровня гомологии ДНК). Считается, что показатель 60-100% гомологии ДНК указывает на родство на уровне вида. Однако общепринятых критериев нет. Метод гибридизации ДНК с рРНК выявляет генетические связи между участком ДНК, контролирующим синтез рРНК, и нуклеотидами рРНК. Цистроны, ответственные за синтез рРНК, консервативны и позволяют выявить родственные связи на уровне рода, семейства. Наиболее надежным является метод секвенирования ДНК. Этот метод выявляет последовательность нуклеотидов в отдельных фрагментах ДНК или всей ДНК хромосомы. Лучшим объектом исследования (наиболее консервативным) является участок ДНК, контролирующий синтез 16S рибосомальной РНК бактерий. ДНК этого фрагмента клонируют, затем секвенируют. Метод секвенирования ДНК позволяет выявить родство бактерий на уровне царства, класса, семейства, рода, но недостаточно чувствителен для установления вида. Этот метод позволяет выявлять эволюционные связи бактерий и является основным в геносистематике. У наиболее важных бактерий изучена методом секвенирования полная последовательность нуклеотидов ДНК хромосомы (кишечная палочка, синегнойная палочка и др.).
Раскрыт генетический механизм весьма важной для медицины проблемы приобретенной лекарственной устойчивости бактерий.
Установлено, что основное значение в быстром формировании устойчивости бактерий к антибиотикам имеют R-плазмиды, несущие гены устойчивости к 1-10 антибиотикам в любых сочетаниях. Они могут передавать гены антибиотикорезистентности чувствительным бактериям за несколько минут, превращая в устойчивую всю популяцию бактерий в организме. До сих пор нет эффективных средств удаления R-плазмид или блокады их передачи. Пока реальным достижением является применение препаратов, блокирующих активность ферментов, разрушающих антибиотики, которые контролируются R-плазмидами. Например, для инактивации бета-лактамазы используют клавулано- вую кислоту, сульбактам, тазобактам в сочетании с антибиотиками бета-лактамной группы.
Установлен генетический контроль факторов патогенности бактерий. Показана возможность локализации этих генов в геномах бактерий, бактериофагов, плазмид. Выявлены механизмы формирования патогенных штаммов среди условно-патогенных бактерий. Эти сведения позволяют выявлять патогенные бактерии молекулярно-биологическими методами и целенаправленно получать авирулентные вакцинные штаммы микроорганизмов.
Крупным достижением генетики является разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), отмеченного Нобелевской премией (Мюллис К., 1993). На основе ПЦР создана принципиально новая универсальная система индикации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний - геноиндикация. Метод ПЦР позволяет амплифицировать («размножить», клонировать) in vitro определенные участки ДНК, за 2-4 ч получить миллионы копий этой ДНК. Сущность метода ПЦР составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий в каждом цикле три этапа - тепловую денатурацию ДНК (плавление), ее отжиг (присоединение синтетических олигонуклеотидных праймеров), синтез (достраивание второй цепи ДНК термостабильной ДНК-полимеразой). Смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси в специальном приборе амплификаторе (термоциклере). Денатурация исходной и последующих копий ДНК, ведущая к разделению ДНК на две одиночные цепи, происходит при 90-95 °С в течение 40- 50 сек. Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 40- 65 °С. Праймеры - синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидов) - присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени, фланкируя искомый специфический фрагмент ДНК. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК; при этом один праймер находится на одной цепи, другой - на противоположной. Синтез (элонгация) - достраивание второй цепи Д Н К происходит при 72 °С с участием Tag-ДНК-полимеразы. Достраивание второй нити ДНК идет с 5"-конца к З"-концу каждой нити ДНК, т.е. в противоположных направлениях. В результате первого цикла образуются две копии участка ДНК, ограниченного праймером. Длительность цикла составляет в зависимости от вида термоциклера 2-2 мин или 30-40 сек. В результате каждого последующего цикла количество синтезируемых копий удваивается в геометрической прогрессии (рис. 3.4). Обычно ПЦР включает 20-30 циклов, что обеспечивает синтез 1 млн копий искомого фрагмента ДНК.
Рис. 3.4.
Для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез или другие системы детекции.
ПЦР адаптирована для выявления большинства микроорганизмов, имеющих медицинское значение. Она позволяет быстро обнаружить искомый микроорганизм непосредственно в исследуемом материале без выявления чистой культуры, имеет высокую чувствительность (1 х Ю 1 - 1 х Ю 3 микроорганизмов в 1 г материала). ПЦР нашла широкое применение для обнаружения трудно культивируемых и медленно растущих микроорганизмов (вирусов, хламидий, риккетсий, микоплазм, спирохет, микобактерий).
Оглавление темы "Оценка роста бактерий. Спорообразование бактериями. Генетика бактерий.":1. Двухфазный рост бактерий. Диауксия. Рост без деления. Оценка роста бактерий. Количественная оценка роста бактерий.
2. Факторы влияющие на рост бактерий. Культуральные среды для роста бактерий. Простые и сложные культуральные среды. Твердые и жидкие культуральные среды.
3. Температура роста бактерий. Мезофильные бактерии. Термофильные бактерии. Психрофильные бактерии. Аэрация бактерий.
4. Величина рН необходимая для роста бактерий. Пигменты бактерий. Виды пигментов. Функции пигментов бактерий.
5. Спорообразование бактериями. Споры бактерий. Спорангии. Эндоспоры. Экзоспоры.
6. Морфология споры бактерий. Строение споры бактерий. Структура споры бактерий.
7. Споруляция бактерий. Стадии споруляции у бактерий. Расположение спор у бактерий.
8. Прорастание спор бактерий. Активация споры. Покоящиеся (некультивируемые) формы бактерий.
10. Внехромосомные факторы наследственности бактерий. Плазмиды бактерии. Виды плазмид. Функции плазмид бактерий.
В наши дни приоритетным направлением естествознания можно считать молекулярную биологию. Она тесно связана с микробиологией и в известном смысле является её детищем, так как в качестве основных моделей использует бактерии и вирусы, а одно из основных направлений молекулярной биологии - молекулярная генетика - долгое время являлась не чем иным, как генетикой бактерий и бактериофагов.
Изучение генетики бактерий имеет также и несомненный прикладной интерес, например в плане установления механизмов передачи патогенных свойств и устойчивости к лекарственным препаратам.
Бактерии - удобная модель для генетических исследований . Их отличает: относительная простота строения генома, позволяющая выявлять мутанты с частотой 10 -9 и ниже; гаплоидность, исключающая явление доминантности; половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток; наличие обособленных, и интегрированных фрагментов ДНК (плазмид, транспозонов и т.д.); лёгкость культивирования и возможность получения популяций, содержащих миллиарды микробных тел.
Как и у других организмов, совокупность генов бактериальной клетки - геном - определяет её свойства и признаки (генотип ). Фенотип бактериальной клетки - результат взаимодействий между бактерией и окружающей средой - также контролирует геном (так как сами признаки закодированы в бактериальных генах).
Генетический материал бактерий
Ядерные структуры бактерий имеют характерное строение, отличающее их от ядер эукарио-тических клеток; их образуют так называемые хроматиновые тельца, или нуклеоиды, лишённые оболочки и включающие в себя почти всю ДНК бактерии.
Ядерные структуры можно наблюдать в фазово-контрастный микроскоп, где они выглядят как менее плотные участки цитоплазмы. Для их выявления в фиксированных мазках предложена реакция Фёльгена-Россенбёка.
В растущих бактериальных клетках нуклеоиды активно делятся, их количество иногда достигает 2-4.
Прокариотический геном
У бактерий обычно имеется одна замкнутая кольцевидная хромосома , содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, то есть бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы обычно сопровождается её делением.
Некоторые виды (например, Brucella melitensis) стабильно содержат две кольцевые хромосомы , другие (Leptospira interrogans) - одну кольцевую хромосому и одну большую плазмиду, третьи - одну линейную хромосому (Streptomyces ambofaciens), то есть обладают сложными геномами.
Бактериальная хромосома содержит до 5*10 6 пар оснований. Для сравнения: геном человека составляет 2,9*10 9 пар оснований. Длина бактериальной хромосомы в развёрнутом состоянии составляет около 1 мм (Escherichia coli).
Некоторые бактерии содержат внехромосомные молекулы ДНК (плазмиды ) и мобильные элементы (либо плазмидные, либо хромосомные).
